分子细胞遗传学实验

分子细胞遗传学实验

实验一 实验二 实验三 实验四 实验五

质粒DNA 的提取 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 显微镜使用与摄影技术 植物染色体制片与观察

荧光原位杂交实验（原位杂交）

实验一 质粒DNA 的提取

一、实验目的

通过本实验学习和掌握碱裂解法和试剂盒方法提取质粒。

二、实验原理

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA ，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。

本实验用的试剂盒是天根公司的普通质粒小提取试剂盒。该方法的基本原理是，在高盐状态下，DNA 纯化树脂ΜLtraPureTM 专一性地吸附DNA ；而在低盐或水溶液状态下，DNA 被洗脱下来。

三、仪器、材料与试剂

1．仪器：恒温培养箱，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅。 2．材料：含质粒的大肠杆菌，1.5mL 离心管，吸头，吸样器。 3．试剂：质粒小量制备试剂盒(质粒DNA 小量提取试剂盒, 天根公司)

常用碱法提取质粒的溶液的参考配方： Solution I 50mmo1／L 葡萄糖

25mmo1／L Tris•HCl(pH8.0)

10 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)pH8.0 Solution II

0.4mo1／LNa0H ，2％SDS(十二烷基硫酸钠) ，使用前等体积混合 Solution III 5mo1／L 乙酸钾 60mL 冰乙酸 11.5mL 水 28.5mL TE 缓冲液

10mmo1／L Tris•HCl

1mmo1／L EDTA(pH8.0) RNA 酶(RNA酶A)

Tris •HCl(pH7．5) 、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL 的浓度，于100℃加热15min ， 缓慢冷却至室温，保存于-20℃。 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

四、实验步骤

I 质粒扩增

将2mL 含相应抗生素的LB 液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

II 质粒的提取（试剂盒操作方法）

1、将3～5ml 菌液12,000rmp 离心30秒收集沉淀（菌体）。 （如果用1.5ml 或2ml 离心管则需要反复离心2～3次）

2、倒掉上清，将沉淀（菌体）完全悬浮于250μL 悬浮液（溶液P1）中。

上清要尽可能去除干净，可用滤纸吸干。沉淀要用混旋器完全悬浮，否则将直接导致下一步的裂解不彻底，进而影响质粒DNA 的产量与纯度。

3、加入150μL 裂解液（溶液P2），轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得粘稠、清亮。

不可用混旋器剧烈振荡，否则会使质粒DNA 断裂时间不宜超过5min ，否则会造成染色体DNA 的污染。

4、加入150μL 中和液（溶液P3），轻柔地颠倒混匀10次左右。 此时可见到白色絮状的染色体DNA 及细菌碎片。

5、向吸附柱（吸附柱放入收集管中），加入500μL 的平衡液BL, 12,000rmp 离心1m ，倒掉收集管中的废液。

6、12,000rmp 离心8～10mim ，将上清液小心转入到吸附柱（吸附柱放入收集管中），12,000rmp 离心30s ，倒掉收集管中的废液。

7、 将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600μL 漂洗液PW （请先检查是否加入无水乙醇），12,000rmp 离心1min ，倒掉收集管中的废液。

如果纯化柱底部残留有异丙醇（或乙醇），可用滤纸吸干。否则将影响以后的酶促反应。 8、重复第7步1次，尽可能将杂质去除。

9、取出纯化柱，将其套入一个干净的1.5ml 离心管，加入50μL TE 缓冲液于（或灭菌的ddH2O ）纯化树脂上，不能沾在管壁上。室温下放置5min 后，13,000rmp 离心1min 。 10、离心管中收集的液体就是洗脱下来的质粒DNA, 取3～5μL 电泳，检测其纯度和目测定量。－20℃保存备用。 若有RNA 污染，可加入0.5μLRNaseA(10mg/ml)，37℃保温10～

30min 。

Ⅲ、质粒的琼脂糖凝胶电泳

取10μL 洗脱液（质粒DNA ）与3μL 溴酚蓝混合，用吸样器加入1% Agarose 作凝胶电泳分析。

五、实验结果

实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

一、实验目的

通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的方法和技术。

二、实验原理

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子。如上次实验提取的HVG18质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalelltly closed circular DNA，简称cccDNA) ，开环质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNAl 条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA) ，线状质粒DNA ，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂(linear DNA，简称LDNA) 。这3种构型的质粒DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA 泳动最快，其次为线状DNA ，最慢的为开环质粒DNA 。

三、仪器、材料与试剂

1．仪器：恒温培养箱，琼脂糖凝胶电泳系统，台式离心机，高压灭菌锅，紫外核酸检

测仪。

2．材料：三羟甲基氨基甲烷(Tris)，冰醋酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，溴酚蓝，蔗糖，

琼脂糖，溴化乙锭，DNA marker，HVG18质粒。

3．试剂：

① 50xTAE(50倍体积的TAE 贮存液) ，配1000mL 50xTAE： Tris 242 g

冰醋酸 57.1 mL 0.5mol／L EDTA 100 mL pH 8.0

② 凝胶加样缓冲液(6x)： 溴酚蓝 0.25％ 蔗糖 40％ 二甲苯青 0.25％ ③ 琼脂糖

④ 溴化乙锭溶液(EB) 0.5ug／mL

四、 实验步骤

1、制备琼脂糖凝胶

按照被分离DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度％ 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

线性DNA 的有效分离范围／kb 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.4～6 0.2～4 0.1～3

称取1.0g 琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热

2、胶板的制备 3、加样

用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA 样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量) 。

4、电泳

接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA 片段从负极向正极移动) 。DNA 的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V ／cm 。

在紫外灯(360nm或254nm) 下观察染色后的电泳凝胶。DNA 存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作用) 。 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm 处，停止电泳。

5、染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE 缓冲液中加两滴溴化乙锭储存液即可) 。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。也可将EB 溶液直接加入凝胶溶液中。

EB染料的全名是3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐。EB 能插入DNA 分子中碱基对之间，导致EB 与DNA 结合，DNA 所吸收的260nm 的紫外光传递给EB ，或者结合的EB 本身在300nm 和360nm 吸收的射线均在可见光谱的红橙区，以560 nm 波长发射出来。EB 染料有许多优点，如染色操作简便、快速，室温下染色15～20min ；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng 或更少的DNA 即可检出。

但应特别注意的是，EB 是诱变剂，配制和使用EB 染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB 的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。

实验三 显微镜使用与摄影技术

一、实验注意事项

显微镜是遗传学实验的重要仪器，使用时必须防尘、防高温、防湿、防药品侵蚀，在清洁保养中要做到以下几点：1．取镜时必须一手提镜臂，一手托镜底，防止显微镜滑落损坏。2．取出显微镜后，先用软毛刷、纱布拂擦镜身的防尘污物，用洗耳球吹去缝隙及镜头上的灰尘和纤维等物，再用镜头纸擦拭物镜和目镜，最后用细白丝绸把镜头再擦一次。3．镜检时物镜只能由低倍镜到高倍镜，在高倍镜下只能用微调螺旋调焦，细心操作，以防压碎玻片，损坏镜头。4．若发现镜头被药物或脏物污染，立即用擦镜纸醮少许二甲苯（以刚湿润纸为度）擦掉污物，再用擦镜纸擦干。5．用完显微镜后进行清洁整理，将载物台放至最低处，转动物镜使之不要对着聚光镜，将显微镜放回原处。

二、实验目的

了解显微摄影的原理和操作过程，掌握拍摄、冲洗胶片、印放显微照片的基本技术。

三、实验原理

显微摄影与一般摄影在原理和操作上基本相同，不同点在于照相机是安装在显微镜的镜筒上，拍摄的标本在物镜头与聚光镜之间的载物台上。只要在照相时调整目镜中观察的图象清晰，照相机底片平面的成像也清晰。

随着多媒体信息处理技术的发展，可以将光学显微镜与计算机连接，直接将光学信号转换成数字图像信息，再运用专门处理软件进行相关分析。

四、涉及知识点

显微成像原理，显微镜和摄影基本知识。

五、实验方法

1．熟悉显微照相装置

（1）显微镜 了解显微镜的分辩率与物镜的数值孔径（N 、A 的关系），孔径愈大，分辨率愈高。复消色差物镜Anochormat 是显微摄影中常用的物镜，当今理想的摄影物镜。平象物镜种类很多种，外壳上刻有不同字样，以资识别。如“Plan ”（平象），“ql ”（广视野平象），“Npl ”（正常视野平象），“Planchromate ”（平象消色差），“pl Ap0”（平象复消色差等）。

附有摄影装置的显微镜，备有摄影目镜，专用于摄影。这种目镜较好的校正象场弯曲，提高成象质量。摄影目镜上刻有“Photo ”、“FK ”等字样。平象目镜刻有“Plan ”，“periplan ”，“GF ”，“GW ”和“Kpl ”等字样。

注意物镜和目镜的搭配要考虑物镜的放大倍数和分辩率。

（2）照相装置 该装置由一小型照相机（或摄像头）、连接照相机（或摄像头）与显微镜的连接筒以及自动曝光系统组成。自动曝光系统用电脑控制，具有自动卷片、自动测光、自动控制曝光时间以及测量色温和倒易律失效的补偿等功能。

（3）照明系统 多采用低压显微镜照相灯为光源，用科勒照明法，使视野内光照均匀，不会烤焦被摄标本，影像清晰。

2．选用合适的感光片及滤色镜

（1）感光片的选择 感光片有硬片（干片）和软片（胶片）。黑白片又有无色片、分色片、全色片之分。彩色片又分彩色反转片、彩色正片和彩色负片等。显微摄影一般使用全色片。

（2）滤色镜（滤光片）的选择 显微摄影利用滤色镜提高影象的反差和清晰度。 3．显微摄影程序

以Olympus PM-10-AD系列自动曝光照相装置、拍摄35mm 黑白片为例。

（1）安装摄影目镜 、（2）安装胶卷 、（3）设定光路 、（4）调节胶片感光值 、（5）校正倒易率失效补偿 、（6）选择拍片规格、（7）选择曝光方式 、（8）选择标本、（9）曝光补偿、（10）对焦取景、（11）选择滤色镜、（12）曝光。

4．黑白胶片的冲洗、晒印和放大相片

（1）胶片冲洗 拍摄完后应在短期内冲洗胶片。了解显影、停影、定影、水洗和晾干等步骤。

（2）印相和放大相片 利用感光纸洗印和放大相片。感光纸的显影、停影和定影过程。 （3）水洗、上光、保存 将相片置流水冲洗1h 左右，置上光机上烘干上光，用裁边机裁边，置阴晾干燥处保存。

实验四 植物染色体制片与观察

一、实验注意事项

本实验在使用显微镜过程中应严格按实验室安全规则进行操作，废液应经专门回收处理以免造成环境污染。

二、实验目的

学习并掌握根尖或叶片材料处理、染色、压片及制片观察的方法。

三、实验原理

高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织(分生区) ，这些分生组织均可以用作制片材料；

预处理主要作用：抑制和破坏纺锤丝的形成来获得更多的中期分裂相；改变细胞质的粘度，促使染色体缩短和分散，便于压片和观察。常用的预处理有物理法、化学法、混合处理法等。

解离：软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离的操作。解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，便于观察染色体。常用的解离方法主要有酸解法和酶解法。

在普通光学显微镜下观察染色体形态结构还需要对材料进行染色，通常采用染色体染色效果好而细胞质着色少的碱性染料、酸性染料或孚尔根试剂染色。

四、实验方法

1．发根 2．预处理

冷处理：将根尖放入盛有蒸馏水的指形管中，置0～4℃的冰箱（或在冰水）中处理24～40h ，染色体数较多的实验材料可适当延长处理时间，但需注意勿使材料结冰。

3．固定 材料经预处理后，用流水冲洗，然后投入卡诺液Ⅰ（3份甲醇∶1份冰乙酸，现配现用）中固定20～24h ，用95％的乙醇洗两次，转入70％乙醇中保存备用。

4．解离 常用酸解法：从70％乙醇中取出固定好的根尖→流水冲洗３min →吸水纸吸干→放入小试管中→加适量1 mol/L HCl于60±0.5℃水浴解离10～15min 。

5．染色

孚尔根反应染色：将解离材料洗净或直接转入席夫试剂于室温(最好在10℃左右) 进行孚尔根染色反应1～5h 或过夜，然后在漂洗液中漂洗3次，每次5～10min ，再经流水冲洗5～10min ，保存于45％乙酸中或1％醋酸洋红复染压片。

6．压片 7．镜检 8. 揭片

实验五 荧光原位杂交实验（原位杂交）

一、实验目的

通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在植物学、生物学、医学等领域的应用。

掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

二、实验原理

荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞

遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。

FISH 的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA 分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a 卫星、卫星III 类的探针，其杂交靶位常大于1Mb ，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp 的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。

三、 实验用具及材料

HVG18探针、植物中期染色体细胞标本、恒温水浴锅、培养箱、染色缸、载玻片、荧光

显微镜、盖玻片、封口膜、200mL 移液器、20mL 移液器、暗盒、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸钠、氢氧化钠。

四、实验方法及步骤

1、 探针的标记

组成 ddH2O

体积 30-x

每反应的量

2.5µmol Tris.cl Ph7.5

10×NT buffer

5

250nmol MgCl2 2.5µg BSA

终浓度

50mM 5mM 50ng/µl

100mM DTT 5 500nmol 2nmol dATP 2nmol dGTP

10mM 40µM 40µM 40µM 10µM 40µM 20ng/µl 1.2 mU/µl 0.2U/µl

1.3mM dNTP mix, equimolar 5

2nmol dCTP 500pmol dTTP

1mM F-x-dUTP, equimolar

DNA DNaseI, diluted DNAPol I

2 x 1 2

2nmol 1µg 60mU 10U

实验操作程序：

（1）在0.5mlPCR 管中依次加入上述溶液。 （2）短暂离心后，水浴锅中16℃反应2小时。 （3）反应后取出放在冰上处理5分钟。

2、 原位杂交程序

（1）在制备好的染色体片子上滴加50-100µL 70%的甲酰胺（用2×SSC配置），盖上盖片。 （2）80℃处理2min ，拿出后迅速甩掉盖片。迅速依次放到-20℃预冷的70%、95%和100%梯度酒精中（各5min 或以上）。处理完自然干燥。 （3）配置杂交体系：（1张染色体制片）

名称 去离子甲酰胺 20×SSC ssDNA B-DNA 50%DS HVG18

用量 7.5µL 1.5µL 1.5µL 1µL 3µL 1µL

上述体系配置完成后，瞬时离心，然后80℃变性10min 。变性完后，迅速放 到冰上处理5min 以上。

（4）把上述体系滴加到玻片上，盖片，放入37℃饭盒里反应8h 以上或过夜。 （5）用镊子将指甲油剥掉，将标本片浸入2×SSC的染色缸中，轻轻摇动使盖片脱落。 （6）清洗：

步骤

洗脱缓冲液

温度条件

洗脱时间

1

2

3

4 2×SSC 2×SSC 2×SSC 1×PBS 室温 42℃ 室温 室温 5min 10min 5min 5min

离心管中加入0.5-1%抗小牛血清（用1×PBS配置）100µL，再加入1µL Fab,涡旋混匀，滴加到盖片上（滴加时标本不要太干燥），盖上盖片，37℃条件下，45min 或以上。

（7）在2×SSC中室温处理2次各5min ，然后在1×PBS室温洗5min 。

（8）自然闭光干燥后滴加PI ，盖上盖片镜检。

五、实验结果