关于血球计数板的使用及问题讨论

血球计数板的使用及问题讨论

李永明整理

《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》学生分组实验，该实验通过探究培养液中酵母菌种群数量的变化，尝试建构种群增长的数学模型并用数学模型解释种群数量的变化，说明制约种群个体数量变化的种群外部环境因素和种群内部因素。

在该实验中，需要测定酵母菌细胞数量。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法等，教材采用的是较为简便、快速、直观的显微镜直接计数法。因此，学会使用血球计数板进行准确计数，是该实验成功与否的关键。

虽然不同版本的教材推荐使用的血球计数板的规格不同，人教版建议使用2mm×2mm×0.1mm 方格，苏教版推荐使用1mm×1mm×0.1mm 方格，但是血球计数板的使用原理和方法是相同的。

一、血球计数板的使用原理

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数，然后推算出含菌数的一种方法。血球计数板是常用的计菌器之一。 血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。 计数器大方格规格：2mm ×2mm ×0.1mm 或1mm ×1mm ×0.1mm 人教版教材默认第一种 这一大方格的长和宽各为1mm ，深度为0.1mm ，其容积为0.1mm 3，即1mm×1mm×0.1mm 方格的计数板；

若这一大方格的长和宽各2mm ，深度为0.1mm ，其容积为0.4mm 3，即2mm×2mm×0.1mm 方格的计数板。在血球计数板上，刻有一些符号和数字(见图一) ，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25个中格；0.1mm 为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示计数室面积是1mm 2，分400个小格，每小格面积是1/400 mm2。

★ 2mm×2mm 方格的计数

2mm×2mm 表示计数室的边长，即一个大方格的边长。由于计数室厚度为0.1mm ，所以计数区的总体积为0.4mm 3。

计数室通常也有两种规格：一种是16×25型，即大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是25×16型，即大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。

1．16×25型的计数板 将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数（见图二）。将每一中格放大，可见25个小格。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：（附：1ml=1cm3=1000mm3, ）

酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/ 100 ×100×10000×稀释倍数

2．25×16型的计数板 中央大方格以双线等分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格，供细胞计数用（见图三）。一般计数四个角和中央的五个中方格（80个小方格）的细胞数。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：（附：1ml=1cm3=1000mm3）

酵母细胞个数／1mL ＝80个小方格细胞总数/ 80 ×100×10000×稀释倍数

★ 1mm×1mm 方格的计数

计数室通常也有两种规格：一种是16×25型，即大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；另一种是25×16型，即大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。

1．16×25型的计数板 将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数（见图二）。将每一中格放大，可见25个小格。计数重复3

次，取其平均值。计

数完毕后，依下列公式计算：（附：1ml=1cm3=1000mm3, 每一个小格的容积为0.00025mm ， 0.00025mm33×400＝0.1mm 。）

酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/ 100 ×400×10000×稀释倍数

2．25×16型的计数板 中央大方格以双线等分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格，供细胞计数用（见图三）。一般计数四个角和中央的五个中方格（80个小方格）的细胞数。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：（附：1ml=1cm3=1000mm3, 每一个小格的容积为0.00025mm ， 330.00025mm ×400＝0.1mm 。）

酵母细胞个数／1mL ＝80个小方格细胞总数/ 80 ×400×10000×稀释倍数

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c d

血球计数板的构造（三）（25×16）

a ．顶面观 b ．侧面观 c ．放大后的网格 d ．放大后的计数室

二、血球计数板的使用方法步骤

使用血球计数板计数时，按照如下的实验步骤进行：

1．镜检计数室。在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数；

2．加样品。将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的酵母菌悬液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，一次性充满计数室，防止产生气泡，充入细胞悬液的

量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。多余培养液可用滤纸吸去；

3．计数。稍待片刻（约5min ），待酵母菌细胞全部沉降到计数室底部后，将计数板放在载物台的中央，先在低倍镜下找到计数室所在位置后，再转换高倍镜观察、计数并记录。

三、血球计数板的使用注意事项

《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》实验是一个历时较长（7天左右）的实验，事前一定要做好周密的计划，定程序、定时间、定人员。每天采用抽样检测法使用血球计数板对酵母菌进行计数，在计数时应从以下几方面注意。

1．每天同一时间，各组取出本组的试管，用血球计数板计数酵母菌个数，并作记录，连续观察7天。

2．从试管中吸出培养液进行计数之前，要将试管轻轻震荡几下，这样使酵母菌分布均匀，防止酵母凝聚沉淀，提高计数的代表性和准确性，求得的培养液中的酵母菌数量误差小。

3．如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应当对培养液进行稀释以便于酵母菌的计数。具体方法是：摇匀试管，取1mL 酵母菌培养液，加入成倍的无菌水稀释，稀释n 倍后，再用血球计数板计数，所得数值乘以稀释倍数。以每小方格内含有4—5个酵母细胞为宜。特别是在培养后期的样液需要稀释后计数。

4．活酵母有芽殖现象，若芽体达到母细胞大小的一半时，即可作为两个菌体计数，若芽体小于母细胞一半时为1个酵母细胞。

5．对于压在方格界线上的酵母菌应当计数同侧相邻两边上的菌体数，一般可采取“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则处理，另两边不计数。计数时，如果使用16格×25格规格的计数室，要按对角线位，取左上、右上、左下、右下4个中格(即100个小格) 的酵母菌数；如果规格为25格×16格的计数板，除了取其4个对角方位外，还需再数中央的一个中格(即80个小方格) 的酵母菌数。

6．计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算，对每个样品可计数三次，再取其平均值。计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。按公式计算每1ml （或10mL ）菌液中所含的酵母菌个数。

7．血球计数板的清洁

血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。

四、关于血球计数板的命题

由于实验《培养液中酵母菌种群数量的动态变化》是新教材新增加的实验，在各地各类命题中都关注了这一实验，并对血球计数板的使用进行了命题设计。从近年来的各类试题来看，试题考查的角度不同，大多数是关于细胞数量的计算，也有关于使用原理和方法的考查，但有的试题明显与血球计数板的实际使用不相符合。

例1 在用血球计数板（2mm×2mm 方格）对某一稀释50倍样品进行计数时，发现在一个方格内（盖玻片下的培养液厚度为0.1mm ）酵母菌平均数为16，据此估算10mL 培养液中有酵母菌 个。

（参考答案： 2×107）

例2 在“探究培养液中酵母菌种群数量的变化”实验中，某同学用显微镜观察计数，统计发现血球计

数板的小方格(2 mm×2 mm)内酵母菌数量的平均值为13个。假设盖玻片下的培养液厚度为0.1 mm，那么10mL 培养液中酵母菌的个数约为

A ．5.2×104 B ．3.25×105 C ．5.2×103 D.3.25×104

（参考答案：B ）

解析一：例1例2两题，均将整个计数室2mm×2mm 方格作为实验计数的空间，并按照公式：a/4×105（×稀释倍数）来计算10mL 培养液中的酵母菌的数量（a 为所计数酵母菌的平均数）。与血球计数板的实际操作不相符，特别是例2中将2mm×2mm 的计数室当成一个小方格了，存在有科学性错误。

例3 通常用血球计数板对培养液中酵母菌进行计数，若计数室为1mm×1mm×0.1mm 方格，由400个小方格组成，如果一个小方格内酵母菌过多，难以计数，应先 后再计数。若多次重复计数后，算得每个小方格中平均有5个酵母菌，则10mL 该培养液中酵母菌总数有 个。

（参考答案：稀释；2×108）

解析二：例3设计了血球计数板的规格，还考查了血球计数板的使用方法，较例1例2更科学合理。根据公式：5×400×10000×10＝2×108 。

例4 检测员将1 mL水样稀释10倍后，用抽样检测的方法检测每毫升蓝藻的数量；将盖玻片放在计数室上，用吸管吸取少许培养液使其自行渗入计数室，并用滤纸吸去多余液体。已知每个计数室由25×16＝400个小格组成，容纳液体的总体积为0．1 mm3。

现观察到图中该计数室所示a 、b 、c 、d 、e 5个中格80个小格内共有蓝藻n 个，则上述水样中约有蓝藻 个／mL 。

（参考答案：5n×105 ）

解析三：从例4来看，是按照血球计数板的原理进行设计试题的，还添加了相应的图示，题意一目了然。按照前面所述的公式，不难得出正确答案：酵母细胞个数／1mL ＝80个小方格细胞总数/ 80 ×400×10000×稀释倍数＝n/ 80×400×10000×10＝5n×105 。

例5（2008江苏高考31．）（4）在整个实验过程中，直接从静置的培养瓶中取培养原液计数的做法是错误的，正确的方法是 和 。

（5）实验结束后，用试管刷蘸洗涤剂擦洗血球计数板的做法是错误的，正确的方法是 。 （参考答案（4）摇匀培养液后再取样 培养后期的样液稀释后再计数（5）浸泡和冲洗）

解析四：例5为2008年江苏省高考试题第31题的第（4）、（5）两小问。试题的设计从血球计数板的实验方法入手，需要对实验操作的正误进行判断，比起以前关于数量的计算的试题，更增强了操作性。

附：

1. 利用血球计数板计数是在显微镜下直接进行的计数，无法判定其死活。当然，也可以通过染色的

方法加以区分。

2. 实验过程中发现，格子中的酵母菌数量过多或有重叠现象，如何处理？

如果发现每小格中酵母菌的个数多于10个，可按以下处理：取1ml 酵母菌培养液加入到盛有9ml 蒸馏水的试管中，摇匀，再计数；如发现酵母菌的个数仍然过大，则同样再稀释一次，直至每小格中酵母菌的个数介于5-10，并作记录。

3. 有无方法进一步提高计数的准确性？

可以选用已知浓度的红细胞作比较得出相对数据，这样的方法有利于减少实验操作的误差，而使得结果更准确。具体方法如下：

取1ml 待测酵母菌培养液与1ml 已知密度的红细胞溶液混合，摇匀，用血球计数板统计出计数室中的酵母菌与红细胞的比例，推算出酵母菌培养液的浓度即可