基因工程稳定型抗肿瘤双特异性抗体研究进展

基因工程T 细胞依赖型双特异性抗体（BiTE ）研究进展

一、介绍

近些年来，双特异性抗体分子（Bispecific antibodies,BsAb）不断在临床疾病的免疫治疗中得到研究应用。越来越多的证据显示，通过基因工程构建的BsAb 在癌症病人的早期和晚期阶段都有很好治疗作用。天然产生的IG 类抗体只能和单一的抗原特异性结合，而通过基因工程构建的IG 类双特异性抗体和多特异性抗体具有和两种以上抗原特异性结合的能力，可以在靶细胞和功能分子之间产生导向性的效应功能。在癌症病人体内T 细胞是控制肿瘤生长和生存的一类免疫细胞。肿瘤抗原特异性的胞毒T 细胞（CTLs ）已经显示能杀死恶性肿瘤细胞，T 细胞免疫应答反应作为人体免疫系统中重要的环节参与抗体依赖型细胞介导胞毒作用（ADCC ），因此构建对T 细胞和肿瘤细胞表面抗原双特异的抗体（bispecific T cell engager,BiTE），可激活静止的T 细胞对靶向肿瘤的杀伤，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。

二、构建模式与稳定性研究

重组DNA 技术提供一条非常便利的双特异性设计道路，CD3分子是T 细胞上普遍存在的表面分化抗原，一个重要的策略是设计以同型CD3分子和另一个肿瘤细胞上的表面抗原为靶点的双特异性抗体，从而激活更多的T 细胞对肿瘤的杀伤力。不同与其他双特异性抗体的是BiTE 不需要对抗原的呈递，目前还不清楚是否其单独与靶细胞细胞或靶分子作用。

2.1 肿瘤细胞靶抗原的选择

选择合理的靶抗原是构建治疗肿瘤BiTE 的初步，首先，必须选择同型且遍布肿瘤细胞的表面抗原，其次该抗原的表达量既要保证抗体能有效结合上去，同时在正常组织中的表达量不能过量到引起抗体造成非特异性伤害。已经报道BiTE 有关的肿瘤抗原有CD19、CD20、癌胚抗原CEA 、表皮因子生长受体等。

CD19和CD20除了干细胞和浆细胞之外的大多数B 细胞表面表达外，还在淋巴瘤和白血病的B 细胞上高表达，选择CD19是BiTE 治疗非Hodgkin 淋巴瘤的一个重要的靶分子抗原。同样CD20也已经作为临床治疗淋巴瘤的一个重要靶分子抗原。Rong Liu 等构建出能特异性结合CD3分子和CD20分子的BsAb ，并将其用于B 细胞淋巴瘤的治疗的研究，当与抗4-1BB/抗CD20的融合蛋白一起使用时，裂解CD20阳性的肿瘤细胞的能力得到加强，在体内实验中，异种移植B 细胞淋巴瘤的免疫缺陷老鼠在DIABODY 和预先激活的人外周血淋巴细胞作用下，肿瘤得到了有效的抑制。

癌胚蛋白CEA 遍布肺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢癌，宫颈癌，乳腺癌，直肠癌和结肠癌等细胞，有报道显示双特异性BiTE,CEA/CD3 抗体可以抑制肺癌迁移皮下组织的生长和发育。Osada 等，用CEA/CD3双特异性抗体对取自化疗后病人的转移性结肠癌细胞进行体外实验，在低浓度下（0.1-1ng/ml），T 细胞抑制癌细胞的生长并促进其凋亡。

人类EGFR 家族由4个不同的受体酪氨酸激酶组成，分别是EGFR 、HER2、HER3和HER4。它们参与激活一系列复杂的细胞信号转导途径，在正常组织中调控细胞的生长、分裂、分化等生理过程。表皮生长因子受体（EGF ）在大部分的人类恶性肿瘤表达，但在许多癌症病人的肿瘤内其临床表达水平低。近20年

来，该靶点分子被广泛的选用于癌症的治疗研究，包括抗EGF 单抗，酪氨酸激酶受体抑制剂等。Asano 等构建人源的抗EGFR （hEx3） 的 BiTE ，并和非人源化的BiTE(Ex3)一起作用于体内和体外的靶细胞的实验，hEx3显示和Ex3一样的结合特性，并抑制靶细胞的生长。在裸鼠模式实验中，hEx3同时在T-LAK 细胞和白介素-2作用下延长裸鼠的存活时间。

2.2 双特异性抗体的结构模型与稳定性研究

目前的BiTE 结构模式大致可分为单链型(single chain)，双链型，双链复合多价型。在过去的十年中通常使用单链的Fv 片段作为基本的结构单元。在VH 和VL 区域之间通常用一个短肽连接，通常为Gly4Ser 。

Orcutt 等，用两个Gly 4Ser 连接肽，将IgG 的VL 的C 末端同ScFV 连接起来，同IgG 的VH 一起，在哺乳动物HEK293细胞中表达，构建了IgG-ScFV ，并通过A 蛋白柱一步法层析纯化。该IgG-ScFv 保留了对原来的结合特异性，同时显示了其类IgG 样的稳定性和体内对肿瘤的靶向性。实验证实，这样的结构对BsAb 的结构的正确折叠并无影响，为单链双特异性抗体的构建提供了一个新模式。

在双链型BsAb 的构建中，制备的关键是使两个单特异型的抗体片段融合成具有双特异性的抗体分子。Kostelny 等在抗CD3和抗IL-2R 的Fab 段羧基端分别加上源于Fos 和Jun 蛋白的亮氨酸拉链序列，将两种Fab 段体外混合，构建成抗IL-2R 的BiTE 。在1996年，carter 和其同事最早引入杵臼结构（Knobs inti holes），他们首先在人IgG 的CH3区用一个大分子氨基酸替换一个小分子氨基酸得到杵突变体T366, 在另外一个CH3区中获得臼突变体Y407。修饰后的CH3结构域的双抗经纯化得到高表达，在钙离子存在下具有非常高的稳定性，该方法已成为BiTE 构建中的常用模式。近年来也有用重组DNA 技术，将两个对不同抗原特异的VHa 和VLb 通过短肽连连接，由于同一ScFv 链可变区之间难以配对而使其已另外ScFv 的同源可变区匹配，表达时形成双特异性双链抗体。（diabody ）。（引证）

为提高BiTE 的稳定性及治疗潜能，人们发展了多价双特异性抗体的构造模式。Cochlovius 等 构建了一种新的四价双特异性抗体串联双链抗体（tandem diabody,tandab ）。tandab 由两条相同的多肽链以非共价键结合形成四价同二聚体，与双链抗体相比，其对靶细胞有更高的亲和力及更强的效应功能，在人血清中的稳定性也更强。多价的双特异性抗体也有分子量过大，使效应细胞表面交联，导致引起全身性效应细胞活化的副反应等缺点。

设计BiTE 分子，各个轻重链结构域之间必须选择适当的连接肽，所以连接肽的长度是保持其构像稳定性的关键，通常选择15个氨基酸(Gly4/Ser)3。由于Fc 区域能影响免疫系统的反应与识别，所以构建稳定的Fc 片段，是影响双特异性抗体免疫活性的重要因素。Miller 等 构建了许多ScFvs 突变体E.coil 文库，并对培养悬浮物进行从热稳定性到抗原结合一系列高通量分析，在基于对文库序列、结构与功能上的数据分析后，发现无论VH 和VL 上单突变型的ScFv 的Tm 平均比野生型scFv 高14℃, 而重组突变型scFv 的Tm 在单突变scFV 的Tm 上额外增加12℃。

三、几种应用型BiTE 在临床肿瘤治疗中的进展

目前BiTE 抗体在临床开发道路上走的最远的是CD19/CD3的双特异性抗肿瘤抗体（bliatumomab ）。在NHL 病人一期临床实验中得到很好的肿瘤消退结果，在二期B-ALL 病人试验中，经过保守治疗后得到很小的肿瘤残余。Bargou 等 对NHL 病人进行低剂量抗体治疗后，在0.015mg/m2剂量下第一次观察到病人淋巴瘤部分和完全的消退，在0.06mg/m2剂量下全部病人都出现肿瘤消退，显示了该BiTE 很好的肿瘤治疗潜能。

第二个已进入临床试验的BiTE 是靶向EpCAM/CD3的MT110。在临床前期的免疫缺陷小鼠模型实验中MT-110和其他靶向EpCAM 特异的BiTE 抗体混合人类T 细胞能根除皮下肿瘤。Brischwein 等构建出一个新颖的单链结构MT110应用于免疫缺陷的小鼠模型中，每天对肿瘤施加1μg MT110，0-4天内所有肿瘤生长受抑制，在8-12天后肿瘤产生耐消退效应。最后，MT110显示能消除所有来自人的转移性卵巢癌。

表一总结出目前BiTE 治疗癌症的发展状况。

四、结语与展望

虽然目前有几十种BiTE 进入临床试验，但也有很多不少问题有待进一步弄清。

（1）不像其它双特异性抗体，BiTEs 不需要另外的抗原对T 细胞的激活。当前尚不清楚其是否对其它靶抗原或细胞引起免疫激活反应，并最终导致全身性毒副作用。