荧光素钠阳离子脂质体的制备及向金黄色葡萄球菌转运的效率_扈本荃

华西药学杂志

W C J #P S 2003, 18(2) :90~93

3 Philip A. Zoretic, Robert J. Chambers. Steros pecific s ythsis of secondary all ylic alcohols:selenxide chemis try[J]. J Org Chem, 1985, 50:298114 GW Cavili, DH Sol omon. Organic oxidation pross part IV. the reaction of lead tetra-acetate wi th some carbonvl compounds [J ]. J Chem Soc, 1955, 4426收稿日期:2002-11

参考文献

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2 刘明生, 谷黎红, 陈英杰, 等1齐墩果酸磷酸酯单钠的合成[J]1中

国药物化学杂志, 1993, 3(1):42

荧光素钠阳离子脂质体的制备及向金黄色葡萄球菌转运的效率

扈本荃, 罗晓星

陕西西安710038

摘要:目的 制备向革兰阳性细菌内有效转运药物的阳离子脂质体。方法 以荧光素钠为标志检测对象, 以大豆磷脂、胆固醇、阳离子脂质为原料, 依次进行旋转蒸发-薄膜水化、超声分散、过膜挤压、冻干, 制备荧光素钠阳离子脂质体。测定该脂质体的包封率和体外释药规律, 流式细胞术(FASC) 检测该脂质体向金黄色葡萄球菌内转运的效率。结果 所得脂质体水合后粒径均匀, 形态完整、规则, 粒径范围20~50nm; 3批脂质体的平均包封率为19. 42%? 0. 31%; 体外释药呈现一级动力学规律, 释药方程为Q =2. 8293+2. 7092T(r =0. 9839) ; FASC 结果表明所制备的阳离子脂质体向细菌内转运率达30. 1%? 12. 5%。结论 制备的阳离子脂质体能够有效地向革兰阳性细菌内转运, 可作为向细菌内递药的良好载体。关键词:阳离子脂质体; 金黄色葡萄球菌; 荧光素钠中图分类号:R944. 1

文献标识码:A

文章编号:1006-0103(2003) 02-0090-04

1

1*

, 廉江平, 王海芳, 韦三华

213

11第四军医大学药理教研室, 陕西西安710032; 21陕西省人民医院药剂科, 陕西西安, 710061; 31第四军医大学唐都医院,

Preparation of uranine liposome and the evalu ation on transfection efficiency on Sta phylococcus Aureu s

HU Ben-quan 1, LUO Xiao-xing 1, LIAN Jiang-ping 2, WANG Hai-fang 1, WEI san-hua 3

1. Department o f Pharmacology , the Fou rth Milita ry Medica l University , Xi . an 710032, China; 2. Department o f Me dical , Hospital o f Shaanxi Province, Xi . an 710061, China; 3. T an gdu H osp ital, the Fourth Milita ry Medical Unive rsity , Xi . an 710038, China

Abstract:OBJECTIVE To prepare uranine cationic liposome and evaluate the transfection efficiency on Staphylococcus Aureus. METHODS The liposomes were prepared by dehydration-rehydration, sonication, extrusion respectively and then lyophilized. The entrapment efficien -cy of uranine in the cationic liposome was detected and the transfection efficiency of the liposome on Sta phylococcus Aureus was evaluated by FASC. RESULTS The results revealed that cationic liposome was regular in its morphology and the diameter range of the liposome was 20-50nm. The mean entrapmen t efficiency of uranine in the liposome of three preparations was 19. 42%.The release properties of the encapsulat -ed uranine from liposome could be expressed by the following equation:Q=2. 8293+2. 7092T(r =0. 9839). The results of FASC indicated that 30. 1%? 12. 5%of Sta phyloccus Aureus had in tegrated the encapsulated urani ne. CONCLUSION The cationic liposome could be an idea vector for delivery of encapsulated drugs into Staphyloccus Aureus . Key words:Cationic liposome; Staphylococcus Aureus ; Uranine CLC number:R94411

Document code:A

Article ID:1006-0103(2003) 02-0090-04

随着抗生素的广泛应用, 细菌对抗生素耐药性的产生和蔓延愈演愈烈。我国的耐药菌问题更为突

出, 由耐药细菌感染引起的死亡率不断上升, 主要原因是耐药菌感染带来的用药困难。细菌耐药的原因之一是细菌改变了自身胞浆膜的通透性, 阻止抗菌

基金项目:全军医药卫生科研基金(02M 008)

药物通过细胞膜进入菌体内[1]。研制向细菌内转运抗菌药的高效递药系统, 是克服细菌耐药的有效措施之一。

革兰阳性细菌的胞壁主要由带负电荷的肽聚糖构成。阳离子脂质体是一种本身带正电荷的脂质囊

*通讯联系人(Correspondent) , 电话:029-3374591, E-mail:XX Luo3@fmmu. edu. cn (, ,

第2期扈本荃, 等。荧光素钠阳离子脂质体的制备及向金黄色葡萄球菌转运的效率 91

泡, 可作为荷负电物质的传递载体, 与荷负电的细菌胞壁产生吸引。荧光素钠是一种生物染料, 其阴离子发光基团与细胞内的脱氧核糖核酸(DNA) 和核糖核酸(RNA) 有一定的亲和力。进入细菌体内后, 在一定波长激发下可发出荧光, 通过流式细胞仪可检测其进入细菌的比率, 衡量载体的转运效率。现特制备了荧光素钠阳离子脂质体, 利用荧光素钠的荧光特性, 检测所制备的阳离子脂质体向细菌内转运的效率。

115 荧光素钠脂质体包封率的测定

精密吸取适量水合好的脂质体混悬液, 置1. 5ml 离心管中混匀, 13000r #min 离心15min, 收取上清液, 用蒸馏水离心洗涤5次, 将上清液收集定容; 用荧光分光光度计在激发波长455nm, 发射波长524nm 处测定荧光值, 计算所得荧光素钠含量即为脂质体混悬液中游离的量(C f ) 。精密吸取等量水合好的脂质体混悬液, 置于10ml 量瓶中, 加10%Tr-i ton-X-100使终浓度为1%, 以磷酸缓冲液稀释至刻度, 在激发波长455nm, 发射波长524nm 处测定荧光值, 计算得到的荧光素钠含量即为脂质体混悬液中总荧光素钠量(C 0) 。

脂质体包封率=(1-C f /C 0) @100%。116 包封率测定的回收率

将适量荧光素钠标准溶液置1. 5ml 离心管中, 13000r #min -1离心15min, 洗涤收集各离心液, 测定其中荧光素钠的量, 计算回收率。在空白脂质体中加入等量荧光素钠, 置于1. 5ml 离心管, 加10%Tr-i ton-X-100, 荧光分光光度法测定上清夜中荧光素钠的总量, 计算回收率。117 脂质体体外释药性能

将水合形成的荧光素钠脂质体, 置37e 条件下缓慢摇匀, 并在0、0. 5、1、2、4、6、8、12、24h 取样, 测定各时间点的荧光素钠含量, 进行释放动力学分析。118 脂质体向细菌内转运效率[2]的测定

接种金黄色葡萄球菌于营养肉汤培养基上, 培养至对数生长期, 用培养基将其稀释到OD=0. 05(K =600nm) 。实验分为4组, 各加入等量菌液(2. 0@108CFU) , 然后分别加入含有相同量荧光素钠的荧光素钠阳离子脂质体、荧光素钠中性脂质体、荧光素钠磷酸盐缓冲液、空白阳离子脂质体; 另设空白对照组加入等量磷酸缓冲液。37e 震荡(200r #min -1) 培养4h 。每组取相同体积菌液置24%蔗糖溶液表面, 4e 离心20min(6000r #min -1) , 弃上清, 加入等量培养基混匀沉淀, 再置于24%蔗糖溶液表面, 4e 离心20min(6000r #min -1) , 弃上清, 加2%多聚甲醛PB S 溶液混匀细菌沉淀, 4e 过夜固定, 用流式细胞仪(FASC) 进行分析。

-1

1 材料和方法

111 仪器与试剂

JE M-2000E X 透射电子显微镜(日本Olympus 公司) ; FLU-960荧光分光光度计(中国上海第一分析仪器厂) ; 冷冻离心机(美国Sorval Biofuge fresco) ; 150型超声仪(浙江象山县石浦海天电子仪器厂) ; OP120旋转蒸发器(瑞士Buchi) ; HZQ-X-100型振荡培养箱(哈尔滨东联电子技术开发有限公司) ; 冷冻干燥机(美国FTS System ) ; 流式细胞仪(美国Beckman -Culter ) 。注射用大豆磷脂(Soybean Lecithin, 上海太伟药业有限公司, 批号:20011020) ; 胆固醇(北京奥博星生物技术责任有限公司, 批号:20010630) ; 荧光素钠(湘中地质实验研究所, 批号:20001017) ; Triton-X-100(华美工程公司) ; 阳离子脂质(sigma 公司) 。112 空白脂质体的制备

称取大豆磷脂125. 4mg, 胆固醇50. 3mg, 阳离子脂质10. 1mg, 溶于5ml 的无水乙醇中, 抽真空旋转蒸发成膜, 置真空干燥器放置6h, 把蒸馏水加入脂膜薄层上水化, 经过旋转洗膜、振荡、漩涡混合分散水化膜得到混悬液, 再经过超声, 依次过0. 45、0. 22L m 微孔滤膜, 均匀挤压, 即得空白脂质体。113 荧光素钠冻干脂质体的制备

取适量荧光素钠水溶液与空白脂质体混匀, 旋转成薄冰, 冻干制得。水合后, 采用透射电子显微镜观察荧光素钠脂质体的外观形态大小和粒度。114 荧光素钠回收率的测定

精密量取10、20、30、40、50、60L l 的荧光素钠溶液(1. 0002g #ml -1) , 分别置于1. 5ml 离心管, 13000r #min -1离心15min, 取上清液; 再加磷酸缓冲液适量, 13000r #min -1离心, 取上清液。重复此操作5次, 将所得上清液定容, 用荧光分光光度计在激发波长455nm, 发射波长524nm 处测定荧光值, 计算荧2 结果

211 脂质体的形态及粒径分布

电镜下观察可见, 脂质体形态完整规则, 边缘整齐, 呈球形或椭球形, 粒径大小分布均匀, 粒径范围

92

华西药学杂志第18卷

率为99. 86%? 0. 51%。214 脂质体体外释药性能

脂质体中荧光素钠释放测定结果表明, 荧光素

钠累积释放百分率符合单指数方程, 即Q=2. 8293+2. 7092T (r =0. 9839) 。最初30min 释药为0. 62%, 24h 脂质体释药率达63. 6%(图2) 。215 脂质体向细菌内转运效率

对照组和空白脂质体组的细菌, 经4h 培养后, 均未在菌体内检测到荧光信号(图3A, 3B) ; 荧光素

图1 荧光素钠阳离子脂质体电镜照片(@150K )

Fig 1 T EM photograph of uranine cationic lipos ome un der transmis -sion electron microscope(@150K)

钠溶液与细菌共培养, 显示较低的荧光转运效率, 仅

在6. 4%? 2. 1%的菌体内检测到荧光信号(图3C) ; 当细菌与荧光素钠阳离子脂质体共同培养4h 后, 在30. 1%? 12. 5%的菌体内检测到荧光信号(图3D) , 而载有荧光素钠的中性脂质体的转运效率仅为3. 2%? 0. 8%(图3E) 。阳离子脂质体的转运效率与中性脂质体的转运效率、未包裹荧光素钠转运效率相比有显著差异(P

212 荧光素钠的回收率

在6个浓度水平上测定了荧光素钠的回收率

(表1) , 表明荧光素钠的测定回收率范围是99. 2%~100. 5%。

表1 荧光素纳的回收率(n =3) T able 1 T he Recovery of uran ine(n =3)

Adde d/L g 15. 1330. 6245. 9361. 2476. 5591. 86

Detec ted/L g 15. 2430. 5745. 5761. 5776. 9091. 57

Recove ries/%99. 5099. 9099. 20100. 50100. 4099. 68

RSD /%1. 581. 831. 950. 761. 951. 38

213 脂质体的包封率及回收率

3次测定所得荧光素钠阳离子脂质体的包封率分别为19. 74%、19. 40%、19. 12%, 平均包封率为19. 4%? 0. 31%。测定荧光素钠溶液的平均回收

图2 荧光素钠阳离脂质体体外释药时-量曲线

Fig 2 Concentration -Time Curve of uran ine releas ed from cationi l-i

posome

图3 对金黄色葡萄球菌转运效率的FASC 分析图谱

Fig 3 Detection of transfection efficiency of u ranine cationic lipos ome on Staphylococcus Au reu s by FASC

A 1阴性对照组(control group) ; B 1空白脂质体组(blank wi th cati onic li posome group) ; C 1荧光素钠溶液组(free uranie li posome group) ; E. 荧光素钠中性脂质体组(uranine neutrality lipos ome group)

3 讨论

常见的脂质体制备方法有反相蒸发法、旋转蒸发-薄膜水化法、超声法、挤压法、透析法、乳化微流体化法等[3]。这些方法制备的脂质体, 或者粒径不均匀, 或者性质不稳定, 不易于保存。本文在以上方法的基础上加以改进, 采用先旋转蒸发-薄膜水

化, 振荡, 再超声、挤压, 最后冻干保存的工艺进行制备, 所得脂质体粒径均匀, 性质稳定易于保存。水溶性药物的脂质体包封率一般较低, 通常在0. 1%~1%[4], 在原料中加入阳离子脂质体提高了带负电的水溶性药物的包封率。理论上阳离子脂质体可使带负电药物的包封率达到100%, 因此该脂质体的处方和工艺在实际应用于抗菌药物时还有待

华西药学杂志

W C J #P S 2003, 18(2) :93~95

于进一步优化。

通过荧光素钠脂质体体外释药试验, 发现释放符合一级动力学方程。37e 时, 释药半衰期为17. 4h, 荧光素钠从水合形成的脂质体中释放缓慢。因此, 水合形成的荧光素钠脂质体在37e 时性质较稳定, 可为体内应用提供依据。阳离子脂质体本身带正电荷, 细菌细胞壁荷负电荷, 通过静电引力, 脂质体吸附于细菌细胞壁, 再通过细菌的内吞作用, 将药物送入细菌体内, 增加药物进入细菌的量。利用脂质体对细菌的跨膜转运, 增加药物进入细菌的量, 使抗菌药物发挥更好的抗菌作用, 本研究制备的阳离子脂质体可作为向细菌内有效递药的一种载体。

参考文献

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单组分胰岛素的研制

朱慧玲, 余 蓉, 曾 蓉, 祁 晖, 杨继虞

四川大学华西药学院, 四川成都610041

摘要:目的 采用新型离子交换膜制备单组分胰岛素。方法 以单峰胰岛素为原料, 用离子交换膜为层析材料快速制备单组分胰岛素, 通过电泳、HPLC 对产品进行纯度分析。结果 制得的单组分胰岛素回收率为72. 37%? 0. 82%(n =3) , 放大实验为74. 16%? 0. 91%(n =3) 。制得的产品电泳检测为单带, HPLC 检测脱酰胺胰岛素含量为1. 10%? 0. 31%(n =9) , 符合美国药典第24版标准。结论 所用工艺可快速制备单组分胰岛素。关键词:单组分胰岛素; 离子交换膜层析; 纯化中图分类号:R977. 1+5

文献标识码:A

文章编号:1006-0103(2003) 02-0093-03

*

The preparation of monocomponent insulin

ZHU Hui-ling, YU Rong *, ZE NG Rong, QI Hui, YANG Ji-yu

West China School o f Pharmac y , Sichuan Unive rsity , Chen gdu 610041, China

Abstract:OBJECTIVE To p repare monocomponent insuli n on a novel ion exchange membrane . METHODS To use anion ex change membrane as the separation material to purify single peak insulin to monocomponent insulin. Usin g the electrophoresis and HPLC methods to analyze the purity of the products. RESULTS The recoveries of monocomponent insulin were 72. 37%? 0. 82%(n =3) and the results of enlarged experi ments were 74. 16%? 0. 91%(n =3) .The complete procedure consumed only a short spell. The product showed single band on electrophoresis analysis. The contents of monodesamido-insulin determined by HPLC were 1. 10%? 0. 31%(n =9) , conforming to the relative standard of USP(24edi tion) . CONC LUSION This technology could produce monocomponent insulin rapidly. Key words:Monocomponent insulin; Ion exchange membrane chromatography; Puri fication CLC number:R977. 1+5

Document code:A

Article ID:1006-0103(2003) 02-0093-03

胰岛素(insulin) 是治疗糖尿病的特效药, 目前国内临床上使用的胰岛素多为结晶胰岛素、单峰胰岛素(single peak insulin, SP-I) 的各种制剂。这些制剂均含有少量的高分子蛋白、脱酰胺胰岛素等杂

*通讯联系人(Correspondent) , Tel:(028) 85501364, 质, 在临床使用时可导致免疫副作用。现采用新型微孔离子交换膜进行层析, 进一步纯化制成单组分胰岛素(monocomponentinsulin, Mc-I) , 该工艺快速, 方便, 能缩短生产周期。