乳鼠原代心肌细胞培养方法与技巧

! 黑龙江畜牧兽医∀科技版

2011年2月(上) 107

乳鼠原代心肌细胞培养方法与技巧

王 丽, 李忠浩

(河北北方学院动物科技学院, 河北张家口075131)

中图分类号:S865. 12

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文献标识码:B 文章编号:10047034(2011) 02-0107-02

细胞培养技术现已广泛应用于生物学和医学研究领域。心肌细胞培养作为一种体外试验研究模型, 可以更方便地从细胞和分子水平研究心血管疾病的发病机制。体外培养的心肌细胞作为多种细胞病理

[1-2]

模型广泛应用于生理、病理和药理研究, 其最主要的优点是具有自发搏动性, 可以不受神经、体液因素条件下各种药物对活细胞的影响, 并且可以节约动物及药品, 从而提高效率。分离培养出高纯度的心肌细胞是对心脏相关疾病进行各种研究的前提和基础。虽然心肌细胞的培养方法已早有报道, 但均存在细胞存活率低、纯度不高等诸多缺陷, 如何使心肌细胞培养的方法更为简单, 并且使分离的心肌细胞达到理想的存活率和纯度, 是体外培养心肌细胞模型的关键问题。为此笔者在多年新生大鼠心肌细胞培养的经验和方法的基础上加以改进, 获得了简单并且稳定、可靠的心肌细胞培养的方法, 现报道如下。1 材料与方法1. 1 试验动物

SPF 级1~3日龄SD 大鼠, 河北北方学院实验动物中心提供, 雌雄不拘。1. 2 试剂

胰蛋白酶和胶原酶, 美国S i g m a -aldrich 公司产品; 胎牛血清, 杭州四季青生物工程材料有限公司产品; DME M 干粉培养基, 美国G i b co 公司产品。1. 3 培养方法

取1~3日龄SD 大鼠乳鼠10只, 用大头针将乳鼠的头和四肢固定, 用75%酒精棉球消毒胸、腹部皮肤; 剪开皮肤, 暴露皮下组织, 更换手术器械, 在大鼠剑突处横剪, 于剑突处正中线稍偏左处向上剪, 成倒T 型, 在心脏跳动下用眼科镊迅速夹取心脏放入盛有用冰预冷的PBS 液体的平皿中; 洗去血凝块和红细胞, 用眼科镊将心脏包膜和附着的血管分离干净, 剪去心房组织, 取心室肌放入青霉素瓶, 洗去残血后将

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心室肌剪成碎块(约1mm ); 用PBS 再次清洗血污, 加入10~15mL 0. 125%胰酶(含0. 02%的EDTA ),

收稿日期:20091123; 修回日期:20100530

作者简介:王 丽(1979-), 女, 讲师, 硕士, w ang li n i 2004@si na . .

热磁力搅拌器搅拌预热到37 (搅拌速度60~

100r /mi n ), 消化8m i n ; 弃上清液, 再次加入胰酶继续消化剩余组织, 重复消化直至碎片几乎完全消化; 分别收集各次消化后的上层细胞悬液置于冰上, 经200目不锈钢网过滤以去除未消化的组织及细胞团, 并马上加等量的10%血清培养液以终止反应, 1500r/mi n 离心8m in ; 弃上清液, 加入1mL 血清培养液, 吹散沉淀细胞, 再次离心(1500r /min 离心8m i n ); 弃上清液, 用10%血清培养液制成细胞悬

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液, 按差速贴壁分离法纯化心肌细胞, 以5 10个/L接种于培养瓶中, 置37 、5%CO 2培养箱中培养1. 5h; 此后每2d 换液1次; 加入终浓度为0. 1mm ol/L5-溴脱氧核苷以抑制成纤维细胞的增殖。1. 4 形态学观察

生长第3天在倒置相差显微镜下观察心肌细胞的形态学变化并摄像。1. 5 心肌细胞的鉴定

心肌细胞免疫组化鉴定一般采用的蛋白是 -横纹肌肌动蛋白。 -横纹肌肌动蛋白仅存在于心肌细胞和骨骼肌细胞中, 在心肌中不存在骨骼肌细胞, 因此笔者采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(SABC ) 免疫细胞化学法检测横纹肌肌动蛋白的表达来鉴定心肌细胞。2 结果2. 1 原代培养的心肌细胞形态学观察

在倒置相差显微镜下观察发现, 刚接种的心肌细胞悬浮于培养液中。培养3h 后, 心肌细胞逐渐贴壁, 呈圆形; 培养12h 后, 心肌细胞已贴壁生长, 呈三角形或扁平形, 偶有自发性搏动, 搏动频率较慢, 有的每分钟仅数次。培养24h 后, 细胞已全部贴壁, 贴壁后呈梭形、三角形或不规则多边形(见图1a); 胞核小, 圆而致密并居中; 胞质颜色较深, 核周胞浆可见颗粒样物质; 90%开始搏动。培养48h 后, 细胞逐渐在皿底表面铺展, 并伸出伪足, 形成不规则的星形并相互接触交织成网(见图1b), 出现自发搏动; 培养72h 后, 心肌细胞融合成片形成单细胞层(见图1c), 局部细胞生长密集处可形成呈放射状排列的细胞簇, 同簇细胞搏动同步化(见图1d), 每分钟120次左右。

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H e ilong jiang A ni m a l Sc i ence and V e teri nary M edicine

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a . 培养24h 心肌细胞贴壁生长(100 ); b . 培养48h 心肌细胞伸出伪足相互连接(200 ); c . 培养72h 心肌细胞融合成片(100 ); d . 培养72h 心肌细胞聚集成团并

同步搏动(400 ) 。

图1 倒置相差显微镜下乳鼠心肌细胞的形态

用免疫细胞化学方法对心肌细胞进行鉴定。图2为心肌细胞横纹肌肌动蛋白单克隆抗体染色的结果。由图2可见:细胞胞浆呈棕黄色细密颗粒, 阳性细胞大部分细胞染色呈阳性(胞核呈蓝紫色) (见图2b), 阳性细胞与在倒置显微镜下观察到的心肌细胞形态一致, 细胞胞体较小, 呈梭形或多角形, 核仁清晰; 心肌细胞呈阳性反应。结果显示心肌细胞分离、纯化效果好, 95%以上的细胞中横纹肌肌动蛋白染色均呈阳性, 提示所培养的心肌细胞的纯度高, 基本无其他细胞污染, 表明此方法培养的心肌细胞可以满足

后续试验的要求。

a . 阴性对照(PBS 代替一抗时心肌细胞免疫组化的结果(100 ); b . 横纹肌肌动蛋白染色为阳性的心肌细胞(100 ) 。

图2 乳鼠心肌细胞横纹肌肌动蛋白的免疫细胞化学染色

3 讨论3. 1 污染的防治

开胸取心脏时应尽量只剪开胸廓, 切忌不要刺破肺脏和腹腔; 培养皿、血清、培养液、手术器械等要严格消毒; 在培养过程中每步操作都应严格遵循试验原则和无菌要求; 心肌细胞的观察、照像时间不可过长, 频率不可太高, 否则会增加污染概率。3. 2 大鼠的选择

一般认为新生大鼠在出生后3d 内心肌细胞都有增殖能力, 可用于心肌细胞培养。笔者认为第2天的新生大鼠最好, 这样可以提高心肌细胞培养的成功率。3. 3 新生大鼠心肌细胞的分离

分离方法包括组织块法和消化法。前者因很难控制成纤维细胞的生长已被淘汰, 现在多采用消化, 透

明质酸酶、D ispase 酶等。常用胰蛋白酶的浓度为

0. 08%~0. 25%, 也可用胰蛋白酶加胶原酶共同消化。胰蛋白酶作用较强, 可分解组织间酪蛋白成分, 但对肌细胞膜蛋白亦有较强的破坏作用, 容易造成心肌细胞的损坏。而胶原酶作用较缓和, 对细胞损伤小, 能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞, 也可在胶原酶中加入牛血清白蛋白(BSA ) 来保护细胞, 提

[3]

高分离细胞的质量。为了减少对心肌细胞的损坏同时不致消化作用太弱, 常将胰蛋白胰和胶原酶混合使用。3. 4 消化时温度和时间的控制

应掌握好消化时间, 时间太短会使消化不完全而造成浪费。温度超过37 时细胞的活力会大大降低, 所以要严格控温。3. 5 细胞的接种密度

细胞接种的密度应根据试验目的的不同而异。如果要检测单个心肌细胞的形态, 接种密度应稍低,

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一般应控制在5 10个/L; 若每孔的接种密度增加

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到1 10个/L, 可提取心肌细胞RNA 或蛋白进行

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测定; 密度大于1 10个/L, 可形成细胞簇并观察到心肌细胞的搏动趋向同步化。3. 6 防止心肌细胞中胶胨样物质的产生

乳鼠心肌细胞对酶的消化很敏感, 如消化过度, 细胞会丧失贴壁及搏动能力, 导致细胞死亡率增加; 而消化不足时, 细胞会聚集成团。在心肌细胞消化过程中, 如果消化不当经常会有胶胨样物质产生, 笔者认为胶胨样物质是不完全消化的产物, 或消化的细胞破裂导致DNA 释放。为防止胶胨样物质的产生, 在消化过程中应注意:(1) 吹打的力度要轻柔, 转速不能过快, 一般在60~100r/mi n 之间; (2) 注意消化液与组织的比例, 消化液的体积可为组织的10倍; (3) 消化过程中可加入DNA 酶来防止由于细胞损伤而释

[4]

放、积聚的DNA, 使积聚在一起的心肌细胞分散。参考文献:

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