动物肝脏中DNA的提取和鉴定

动物肝脏中DNA 的提取和鉴定

一、实验目的

1. 学习并掌握动物组织总DNA 的提取方法及其原理。

2. 掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。

3. 学习核酸染色的方法。

二、实验原理

为了研究DNA 分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取DNA 。由于DNA 分子在生物体内的分布及浓度不同，要选择适当的材料提取DNA 。动植物中小牛胸腺、动物肝脏、脾脏、鱼类精子、植物种子的胚中都含有丰富的DNA 。微生物中，谷氨酸菌体含7%～10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠杆菌9%～10%。

从各种材料中提取DNA 方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物，如从病毒中提取DNA 比较容易，多数病毒DNA 相对分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从细菌及高等动植物中提取DNA 难度大些。细菌DNA 相对分子质量较大，一般达2×109Da 。因此易被机械张力剪短。细菌DNA ，除核DNA 外，还有质粒DNA 等。

1.DNA 的基本功能

生物遗传信息复制的模板和基因转入的模板，是生命遗传繁殖的物质基础，也是个体生命活动的基础；作为DNA 分子中的某一区段，有复制、转录和翻译等主要功能称为基因。

2. 核酸的结构与功能

核酸（nucleic acid)是以核苷酸为基本组成的生物大分子。天然存在的核酸有两类，一类为脱氧核苷酸（deoxyribonucleic acid,DNA)，另一类为核糖核酸（ribonucleic acid,RNA) 。DNA 存在于细胞核和线粒体中，携带遗传信息。RNA 存在于细胞质和细胞核内，参与细胞内DNA 遗传信息的表达。

3.DNA 的存在形式

天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白（DNP ）形式存在于细胞核中。要从细胞核中提取DNA 时，先把DNP 抽提出来，再把P 除去，再除去细胞中的糖、RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。DNP 和RNP 在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP 在低浓度盐溶液中几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中溶解度很大，比纯水高2倍。RNP 在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此在提取时

常用此方法分离这两种核蛋白。

4. 核酸的理化性质

RNA 和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA 则为白色类似石棉样纤维状物。除肌甘酸，鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA 、RNA 和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA 钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA 在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中。DNA 、RNA 易水解，在中性或弱碱性溶液中稳定。

5. 细胞的破碎

细胞有坚硬的细胞壁，首先要破碎细胞。方法有三种：

（1）机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；

（2）化学试剂法：用SDS 处理细胞；

（3）酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞破碎。

6.DNA 的提取方法（在这里只介绍浓盐法）

利用RNP 和DNP 在电解溶液中溶解度不同，将两者分离，常用的方法是用1mol/L氯化钠提取抽提，得到的DNP 粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡，使之乳化，再离心除去蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA 位于上层水相中，用2倍体积95%乙醇可将ＤNA 钠盐分离出来。也可用0.15MNaCl 液反复洗涤细胞破碎液除去RNP ，再以1mol/L NaCl提取脱氧核糖蛋白，再按氯仿-异戊醇法除去蛋白。两种方法比较，后种方法使核酸降解可能少一些。以稀盐溶液提取DNA 时，加入适量去污剂，如SDS 可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中DNase 对DNA 的降解作用，在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的络合剂。通常用1.5mol/L NaCl ，0.015mol/L柠檬酸钠，并称为SSC 溶液，提取DNA 。

7.DNA 的琼脂糖凝胶电泳

DNA分子在PH 值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA 分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了荷电效应外，还有分子筛效应。由于DNA 分子片段的相对分子量不同移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA 片段分离。 0.6%～1.4%琼脂糖凝胶适用于3×106～11×106相对分子质量的DNA 分子或片段的分离，所需DNA 样品量为0.5～1.0ug 。

琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA 可用溴化乙啶染色。

溴化乙啶分子可插入DNA 双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm

波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙锭检测DNA ，可检出10-9g 以上的DNA 浓度。

三、材料、试剂与仪器

(一) 材料：动物肝脏

(二) 试剂

（1）0.14mol ／LNaCl －0.15mol ／L EDTA-Na溶液：

（2）20％SDS 溶液：

（3）氯仿一异戊醇(24:1)混合液：

（4）95％乙醇溶液。

（5）80％乙醇溶液。

（6） pH8.0TE缓冲液：10 mmol／LTris －HCI ，lmmol ／L EDTA，其中含RNA 酶20ug ／ml 。

（7）电泳缓冲液：Tris-硼酸－EDTA （50×TBE ）pH8.0。

（8）加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（BPB ）40%蔗糖。

（9）溴化乙啶（EB ）溶液：10μg/ml。

（10）琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。

(三) 仪器

（1）稳压稳流电泳仪 （2）可调微量移液器

（3）水平电泳槽 （4）暗箱紫外透射仪等。

四、实验步骤

1．取新鲜动物肝，称取2g ，切成小块，加入4ml 0.14mol ／L NaCl －0.15mol ／L EDTA 溶液，于研钵中研磨至匀浆，4ml 清洗转入离心管中，以4000r ／min 的转速离心 10min。

2．在上述沉淀物中加入0.14mol ／L NaCl－0.15mol ／L EDTA溶液，使总体积为 4mL，然后在60℃下，滴加 20％SDS 溶液2－3滴，边加边摇动，再摇动 10min，使核酸与蛋白质分离。

3. 加固体氯化钠0.4g 混匀，使其最终浓度达到l.4mol ／L ，水浴30min 。

4．加等体积的氯仿一异戊醇，混匀，摇动5min 以4000r ／min 的转速离心10min 。离心管内的物质分为三层，上层为含DNA 的水相层，下层为氯仿一异成醇混合物，中间层为变性蛋白凝胶。

5．吸出上清液，加入2倍体积95％乙醇溶液（预冷），产生沉淀。

6.再以4000r ／min 的转速离心溶液10min ，弃去上清液 (沉淀用80％乙醇溶液离心洗涤) 。

7．将沉淀置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥后，加入200ul TE 缓冲液，使DNA 充分溶解，待用。

8.凝胶板的制备：

（1）取琼脂糖0.7 g ，加1×TBE 缓冲溶液100ml ，于沸水浴中至熔化，制成0.7%的琼脂糖胶液。

（2）胶床两头贴上防水胶带，形成8mm 高的挡墙，压紧胶带，置水平台面上。

（3）插入梳子，梳齿下端离板底0.5－1mm 。

（4）在胶床上滴加2－3滴 0.5μg/mL的EB 溶液。

（5）将60℃凝胶不间断倒入胶床，高3－4mm ，避免气泡，摇匀，室温下凝固。

（6）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，高于胶面1－2mm ，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气泡。

9.加样：

将样品DNA 溶液与加样缓冲液以5 ：1的体积比混合，用微量移液器加样，每加完一个样品，冲洗三次。加样量15～20 l （加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部）。

10.电泳：

为了获得电泳分离DNA 片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）开始时用较高电压(80V)，样品一进入胶内则将电压调至5V/cm 。当染料前沿移至底边1-2mm 时，电泳毕。

11. 观察

关闭电源，取出胶床，在紫外检测仪下观察凝胶中的DNA （红橙色荧光）。

五、实验预期结果与分析

观察动物肝脏中DNA 的提取电泳图，分析DNA 的提取结果和DNA 的纯度。

参考文献

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