DNA甲基化检测

1. DNA甲基化检测: Southern Blot杂交, Bisulfite Sequencing and

McrBC-PCR

a) Southern Blot

将从四周左右大小拟南芥的莲座叶中提取的DNA，用对甲基化修饰敏感的限制性内切酶酶切后于0.8%琼脂糖凝胶中电泳，参照丁勇师兄总结的方法（具体步骤见下），用湿转法将其转至尼龙膜上，80度真空烤2小时，与探针于65°C杂交16-20小时，经严谨性洗膜后用Phosphoimager进行分析。

PCR primers for amplifying probes:

Promoter of FLC

FLC-P75: CGAGCAAAGGAATGCAAATT

FLC-P42: TTGTGCCTATCTACTTTTTC

hAT Element within MPF

Ty3-p1: ACAATAAAAT GATAATAGTA AGGC

Ty3-p2: CTCACGTTAGTCATGGGTAG

1) 基因组DNA用限制性内切酶酶切后于是0.8%琼脂糖凝胶中电泳，电泳胶图

经凝胶成像集后，将胶于变性液中（1.5M NaCl, 0.5M NAOH）变性45min，再将胶于中和液中（1M TisCL，1.5M NaCl）中和45min。

2) 采用半干转移法用20×SSC为转膜液，将基因组转至尼龙膜上，用紫外交联

器分别交联系30秒，并在80℃下真空干燥2小时。

3) DNA探针用Klenow酶标记，方法为：模板：100-200μg，Random primer:1μl

(500 ng/μl)，5mM dNTP(不含有dCTP): 2μl，用ddH2O补齐为10μl. 99℃变性3-5分钟。冰上放置3分钟。10×Klenow buffer: 2μl，P 32dCTP: 3 μl, Klenow: 2μl,于37℃中放置1小时。再将探针于99℃变性3分钟，冰上放置3分钟后加入杂交管中。

4) 65℃杂交过夜，经2×SSC，0.1%SDS，洗膜两次，每次数10分钟；0.1×SSC，

0.1%SDS，洗膜两次，每次数10分钟后，用Typhoon 8600(Amersham pharmcia biotech)进行扫描。

变性液：1.5M NaCl, 0.5M NaOH

中和液：1M Tris, 1.5M NaCl, pH调至7.2

杂交液：0.5M磷酸钠缓冲液，pH 7.2，7% SDS， 10mMEDTA。

b) Bisulfite Sequencing

Bisulfite sequencing完全按照Steve Jacobsen实验室的protocol操作，注意DNA的纯度一定要高，否则可能影响后续的酶切以及Bisulfite处理。

1) 取植物基因组2μg以上，用两种的限制性内切酶（选择不切检测区域内部的）

大于100μl体系过夜酶切，等体积的酚/氯仿抽提，加入2μl糖原和1/10体积NaOAC助沉，3.5倍体积的乙醇沉淀。13000 rpm离心15分钟，70% EtOH洗涤沉淀。

2) 离心后将沉淀溶于20μl体积的水中，转移到500μl小管中（以下加热步骤均

在PCR仪上完成，Eppendorf白头）于97℃5分钟后，暂停PCR仪，冰上放置2分钟。

3) 加入新鲜配置的1μl6.3M的NaOH后，于39℃处理30分钟，暂停PCR仪，

加入208μl的bisulfite solution变性。

4) 变性处理：55℃ 3 小时、95℃ 5分钟，进行5个循环，最后55℃1小时。

5) 将经过处理的产物利用Qiagen PCR purification Columns去盐，100μl EB洗

脱。加入终浓度为0.3M的NaOH （5μl 6.3M NaOH），37℃度处理15分钟。

6) 经过处理后的DNA，加入3.5倍体积的乙醇，2μl糖原，1/10体积NaOAC

沉淀。13000 rpm离心15分钟，70% EtOH洗涤沉淀。

7) 离心后样品溶于100 μl 的TE 溶液 (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA, pH

8.0)。

8) 以处理的DNA样品为模板，用特殊设计的BS专用引物扩增，将扩增后的

产物连入pGEM-T载体中，转化DH5α后，挑取单克隆，提取质粒后测序并统计。

试剂配制：

Bisulfite solution: 40.5克的亚硫酸钠 (Fisher S654-500) 溶于80 ml的水中, 将pH调至5.1，后加入3.3 ml 20 mM的对苯二酚(Sigma-Aldrich H-9003)，再将

体积定溶到 100 ml。

Primers for Bisulfite Sequencing at FLC (changed nucleotides from C to T or G to A are shown as lowercases).

B1 f (CX1582): TTTGAAAGTttATGAAAATtATTTGGTTAGTAtTtAAT

B1 r (CX1584): AATTaaATTaTATTTACCACAAAAaTaTACTTATAA

B2 f (CX1635): GTGTTGtAAAATtGTAAATTtAATtTAATtTTATGGG

B2 r (CX1637): CTTaCAAATCAaATCAATAaTTAAACAAAAaTAAAaAACATT

B3 f (CX1640): GAGTAAAATAAttTTAGTTtAAAAtATTAGATATGTAATGG

B3 r (CX1642): TTTaTTAAAAAATaTTATATTAaACACTTaAAAaaTaAaaC

B4 f (CX2051): AAAATTtAAATtATGTTAGATAAAtAAAAAAAAATTTG

B4 r (CX2053): CCACTaaAAACTATaAAACATTaAaAAAACACCTTACC

No.10 locus f (CX2352): TTGAtGttTTTGAGAGAtATGGAATtTTGTGTTTTGTAG No.10 locus r (CX2353): CACTCTAaCaCTTCCTTCCACTCCATaATCTaATCTCCTC B1 degenerated primers are used for the analysis in Col x Ler F1 heterozygous plants B1 degenerate f (CX2412): TTTGAAAGTYYATGAAAATYATTTGGTYAGTAYTYAAT B1 degenerate r (CX2413): AATTRRATTRTATTTACCACAAAARTRTACTTATAA The BS AtSN1 primers had been previously described (Zilberman et al., 2003). c) McrBC-PCR

McrBC可以切割甲基化的DNA序列，因此可以用来很灵敏的检测目标区域是否发生了DNA甲基化 (Ding et al., 2007; Rabinowicz et al., 2003)，本文中与real-time PCR技术相结合使用更近一步提高了结果的灵敏度和可靠性。此方法与Southern和Bisulfite sequencing相比较，DNA用量非常小而且操作简洁，周期短，因此强烈推荐作为甲基化状态初步检测的手段。以拟南芥为例，四周左右大小的一片莲座叶所提取的DNA，溶于50μl水中，只需取0.3～0.5μl进行McrBC酶切即可，酶切后的产物取2μl直接进行PCR（与不加McrBC的对照组一起），注意在PCR时控制扩增保持在对数期内（real-time则无需考虑此问题）。

以下为一50μl的酶切体系示例：

10 x NEB buffer 2: 5μl

100 x BSA 100 x GTP DNA 模板 McrBC酶

水 0.5μl 0.5μl 0.3μl 0.5μl（对照组加水） 43.2μl