土壤酶活性测定

土壤与环境微生物研究法/李振高,骆永明,滕应编著.一北京:科学出版社,2008 过氧化氢酶(398-399)脲酶(404-405)磷酸酶(412-413) 关松荫/土壤酶及其研究法 农业出版社 1986年七月第一版 蔗糖酶274-276

土壤脲酶(urease)活性的测定方法:靛酚比色法 (一)方法原理

土壤中脲酶活性的测定是以尿素为基质,酶促水解生成的氨与酚类化合物起反应生成蓝色的靛酚,颜色深度与氨含量相关,因而用于脲酶活性的测定。

(二)试剂

1)甲苯

2)10%尿素:称取10g尿素,加蒸馏水90ml。

3)柠檬酸盐缓冲液(PH6.7):取184g柠檬酸溶于300ml蒸馏水中,另取147.5g KOH溶于蒸馏水,再将二种溶液合并,用1N NaOH将pH调节至6.7,用水稀释至1L。

4)苯酚钠溶液(1.35mol/L):

62.5克苯酚溶于少量乙醇,加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮,用乙醇稀释至100毫升(A液),存于冰箱中;

27克NaOH溶于100毫升水(B液),存于冰箱中。

将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将两种溶液各20ml混合,用蒸馏水稀释至100ml。

5)次氯酸钠溶液:用水稀释试剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。

6)氮的标准溶液:精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000mL,得到1mL含有0.1mg氮的标准液(100ppm)。

(三)测定步骤

(1)标准曲线绘制

吸取配置好的氮溶液10mL,定容至100mL,即为10ppm,吸取0、1、2、3、4、5、10、15、20 mL移至50mL容量瓶,加水至20mL,再加入4mL苯酚钠,仔细混合,加入3mL次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度。即为0、0.2ppm、0.4ppm、0.6ppm、0.8ppm、1ppm、2ppm、3ppm、4ppm的标准曲线。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定,以标准溶液浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

(2)土壤中脲酶活性的测定

称取10g土壤置于100ml容量瓶中。用2mL甲苯处理15分钟。往瓶中加入10mL 10%尿素溶液和20mL柠檬酸缓冲液(pH6.7)。仔细混合后,将瓶放在37℃恒温箱中,放置24 h。之后用38℃水定容至100ml(甲苯浮在刻度线上)。与此同时,进行以水代替基质(10ml 10%尿素用10ml蒸馏水代替),及无土对照测定。

培养结束后,将悬液过滤。吸取3mL(视情况而定)滤液于50mL容量瓶中,用蒸馏水加至10mL。然后按标准曲线绘制的操作加入苯酚钠等试剂,显色,比色,最后根据标准曲线求出氨态氮含量。

以每克土壤在37℃下24h内酶解尿素释放的NH3-N 的毫克数来表示脲酶活性。

二. 过氧化氢酶测定(容量法)

1. 试剂配制

a. 0.3%过氧化氢溶液:将10ml 30%的过氧化氢用水稀释至1L,此溶液不稳定,需临时配置。

b. 1.5mol/L 硫酸:8.4ml浓硫酸溶于水,再用蒸馏水稀释至100ml

c. 0.002 N KMnO4溶液:称取化学纯高锰酸钾0.3161g,溶于1升蒸馏水中,贮于棕色瓶中,备用。如果知道酶活性很高的话 可以适当变化高锰酸钾浓度

2. 操作步骤

(1)取5g过1mm风干土,置于150mL三角瓶中,并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%H2O2溶液。

(2)同时设置对照,即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3%过氧化氢溶液,而不加土样。并作无土对照。

(3)将三角瓶放在振荡机上振荡(120r/min)30min后,加入5mL 1.5mol/L硫酸,以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。吸取25mL滤液,用0.002N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点(30s不退色)。

3. 结果计算

以单位土重消耗的0.002moi/l高锰酸钾毫升数(对照与试验测定的差)表示土壤过氧化氢酶活性,其计算式为土壤过氧化氢酶活性(ml KMnO4/g干土)=V/dwt

式中,V为0.002mol/L高锰酸钾毫升数(ml);dwt为烘干土壤重量(g)。

用于滴定土壤滤液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为B,用于滴定25mL原始的过氧化氢混合液所消耗的高锰酸钾量(毫升数)为A。

(A-B)×T即为过氧化氢酶活性

高锰酸钾溶液标定

吸取2ml0.1N草酸钠标准液于200ml三角瓶中,并加水至80ml左右,投入几粒玻璃珠,再加5ml1:3的硫酸酸化,在电炉上加热2min,取下稍冷,趁热(70-80度)用高锰酸钾溶液滴定,滴至为红色(30s不退色)即达到终点,记下高锰酸钾的毫升数(V)。高锰酸钾溶液标准浓度按下式计算

c(1/5KMnO4)=m/(V1-V2)*0.06700

式中 c(1/5KMnO4)=—高锰酸钾标准液之物质的量浓度,mol/L;

m——草酸钠之质量,g;

V1——高锰酸钾溶液之用量,mL;

V2——空白试验用高锰酸钾溶液之用量,mL;

0.06700——与1.00mL高锰酸钾溶液c(1/5KMnO4)=1.000mol/l相当的以克表示的草酸钠的质量。

土壤磷酸酶测定方法:磷酸苯二钠法

磷酸酶( phosphatase)能酶促有机磷化合物的水解。试验表明,土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用;某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况(特别是磷的状况)。

(一)基本原理

土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、α或β-萘磷酸酯和Р-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。当它们被酶促水解时,能析出无机磷和基质的有机基团。因此磷酸酶活性的测定是测定基质水解后的无机磷或酚的部分。这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。该法可用于测定各种磷酸酶的活性:碱性磷酸酶(用pH 10的硼酸盐缓冲液),中性磷酸酶(用pH 7.0的柠檬酸盐缓冲液),酸性磷酸酶(用pH 5.0的乙酸盐缓冲液)。

(二)实验试剂

1.酶促反应试剂

1)甲苯。

2)苯磷酸二钠溶液:将6.75g苯磷酸二钠溶液(C6H5P04Na2·2H20)溶于水,并稀释至1000mL(1mL含25mg酚)。

3)乙酸盐缓冲液(pH 5.0):称取136g乙酸钠(C2H302Na)溶于700mL去离子水,用乙酸调节至pH5.0,用去离子水稀释至l000mL。

4)柠檬酸盐缓冲液(pH 7.0):称取300g柠檬酸钾(C6H507K3)溶于700mL去离子水,用稀盐酸调节至pH7.0,用去离子水稀释至1000mL。

5)硼酸盐缓冲液(pH 9.6与pH 10.0):称取12.404g硼酸(H3B03)溶于700ml)去离子水,用稀NaOH溶液调节至pH 10.0,用去离子水稀释至1000ml。

2.测定试剂

1) Gibbs试剂:将200mg2,6-双溴苯醌氯酰亚胺(C6H2BrCINO)溶于乙醇,并稀释至100mL。

2)标准溶液:(a)母液:lg酚溶于蒸馏水中,并稀释至1000ml_,溶液保存在暗色瓶中;(b)工作液:10mL溶液(a)稀释至1000mL (lmL含10μg酚)。

(三)操作步骤

1)取10g过1mm筛的风干土样置于l00mL容量瓶中,用1.5mL甲苯处理(泥炭土用5 rnl_甲苯)。

2)处理15rnin后,注入l0mL苯磷酸二钠溶液和l0mL相应的缓冲液(根据磷酸酶的性质确定)。

3)将反应混合物置于37℃恒温箱中,培养3h后(若不显色或显色不明显,则时间可增至24h),用38℃的热水将瓶中内容物稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),再用致密滤纸过滤。

4)对每一土样,设置用10mL水代替苯磷酸二钠基质的对照。并作空白无土对照

5)比色程序:

a取滤液1ml置于100ml_容量瓶中,加5mL相应的缓冲液(根据酶的性质确定),用水稀释至25mL,加1mL Gibbs试剂。

b将反应物仔细混合,静置20min。这时溶液呈现青色。

c用水将瓶中混合物稀释至刻度,并在24h内,用lcm液槽,在分光光度计上于波长578nm处测定颜色的深度,读取消光值。

d以供试样品所得消光值减去对照样品消光值的差,根据标准曲线,求出酚量。当酚含量小于50mg时,用2~4cm液槽进行比色。

土壤磷酸酶活性,以每百克土的酚毫克数表示,其计算式为

土壤磷酸酶活性[μg苯酚/(g干土·h)]一(C×V)/dwt

式中,c为土壤滤液中苯酚含量( rug/mL);V为土壤溶液体积(mL);dwt为烘干土壤重量(g)。

土壤蔗糖酶测定方法

转化酶(蔗糖酶)存在于所有土壤中,它能酶促蔗糖分子中果糖残基内的β-葡萄糖苷碳原子处的键裂解,使蔗糖水解成还原己糖(葡萄糖和果糖),其反应式如下:

C12H22O11+H2O C6H12O6+C6H12O6

土壤的转化酶活性,与土壤中的腐殖质、水溶性有机质和黏粒的含量以及微生物的数量及其活动呈正相关。随着土壤熟化程度的提高,转化酶的活性亦增强。人们常用土壤的转化酶活性来表征土壤的熟化程度和肥力水平。

蔗糖酶与土壤许多因子有相关性,如与土壤有机质、氮、磷含量,微生物数量及土壤呼吸强度有关,一般情况下,土壤肥力越高,蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关,因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 蔗糖酶

二、试剂

1)酶促反应试剂:基质8%蔗糖,pH5.5磷酸缓冲液:1/15M磷酸氢二钠(11.876g Na2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中)0.5ml加1/15M磷酸二氢钾(9.078g KH2PO4溶于1L蒸馏水中)9.5ml即成,甲苯

2)葡萄糖标准液(5mg/mL)

预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中,用蒸馏水溶解后,移至100mL容量瓶中,定容,摇匀(冰箱中4℃保存期约一星期)。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象,则应弃之,重新配制。

3) 3,5- 二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)

称0.5g二硝基水杨酸,溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中,再加30g酒石酸钾钠,用水稀释定容至100ml(保存期不过7天)。

三、操作步骤

(1)标准曲线绘制

吸5mg/mL的标准葡糖糖溶液10ml于100ml容量中,定容。从中吸取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.5、2、3ml于50ml容量瓶,加DNS试剂3mL混匀,于沸水浴中准确反应5min(从试管放入重新沸腾时算起),取出立即泠水浴中冷却至室温,定容。即为浓度为0ppm、2ppm、4ppm、8ppm、12ppm、15ppm、20ppm、30ppm的标准曲线。以空白管调零在波长508nm处比色,以OD值为纵坐标,以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

(2)土壤蔗糖酶测定

称取10.00 g土壤,置于100mL容量瓶中,注入30ml 8%蔗糖溶液,10ml pH 5.5磷酸缓冲液和1ml甲苯。摇匀混合物后,放入恒温箱,在37℃下培养24h。到时取出,迅速过滤。从中吸取滤液2~10ml(适量,无蔗糖对照吸取20ml),注入50ml容量瓶中,加3ml DNS试剂,并在沸腾的水浴锅中加热5min,随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色,最后用蒸馏水稀释至50ml,并在分光光度计上于508nm处进行比色。(为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差,每一土样需做无基质对照,整个试验需做无土壤对照;如果样品吸光值超过标曲的最大值,则应该增加分取倍数或减少培养的土样。)


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