软琼脂克隆形成试验方案

软琼脂克隆形成实验

1. 基本原理及实验目的

软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞，某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮状态下不能增殖，不适用于此法。某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下能增殖，其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。

2. 主要试剂

1）5%琼脂溶液：称取5g琼脂粉(低熔点)，溶于100ml生理盐水，高压灭菌备用。

2）0.25%胰蛋白酶、含10%胎牛血清的培养基。

3. 操作步骤

1）取对数生长期的细胞，0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞沉淀。

2）完全培养基重悬，适当稀释后活细胞计数，调整细胞密度至1×10个/ml。

3）取0.5ml细胞悬液（即500个细胞），加入培养基，使体积达到9.4ml。37℃孵育。

4）底层琼脂的制备：5%琼脂置于沸水浴中，使之完全融化，取出1ml移入无菌小烧杯中，待冷却到50度时，迅速加入9ml预温37℃的完全培养基，混匀后立即取08ml浇注24孔板，室温凝固。

5）上层琼脂的制备：步骤3中预温的9.4ml细胞悬液中加入0.6ml 50℃的5%琼脂，迅速混匀，立即取08ml浇入24孔板，置室温凝固，每孔即含有40个细胞，一般每个实验组重复3个样本。

6）常规培养2-3周。

7）将培养板置于显微镜下计数克隆数，每个细胞集落含50个或大于50个细胞为1个克隆，计算克隆形成率，拍照。

集落数=n孔中细胞集落数总和/n

克隆形成率=（集落数/接种细胞数）100%

8）统计学分析：根据集落数和克隆形成率进行t检验，分析不同组别之间的差异。 3

4 注意事项

1）软琼脂克隆的操作相对复杂，在实验过程中一定要注意无菌操作。

2）在将琼脂于培养基混匀时，要注意琼脂温度，而且动作要迅速，避免局部结块。