流式细胞技术和流式细胞仪知识扩充

一、荧光染料在流式细胞术中的应用

（一）碘化丙啶染色

碘化丙啶(propiolium iodide，PI)能嵌入DNA双螺旋中，可使荧光强度增加约20倍，以488nm波长激发，DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm。

1. 小鼠Lewis肺癌细胞DNA含量测定方法

（1）从C57BL/6小鼠上切除肿块，在培养皿内用PBS冲洗。

（2）去除结缔组织及脂肪，剪碎肿块。

（3）小碎片移入1.20×38mm注射针,加压使其通过,于4℃条件下重悬细胞于HBSS中。

（4）将200～300μL细胞悬液(5×10细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL)，染色3LL细胞，于4℃存放20～30分钟。

（5）测定580～750nm之间的发射荧光，以去除末结合PI产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。

注：PI染色液：0.1%柠檬酸钠1000mL+PI 5mg + 1% Nonide P40水。 5

2.培养细胞DNA的流式细胞仪分析

（1）从培养皿中吸去培养基，以HBSS冲洗二次。

（2）加入PI5mL于培养皿中，在4℃放10分钟。

（3）用吸管反复次打细胞，使细胞破坏，胞核释放出来，再行流式细胞仪分析。

3. 完整细胞DNA的PI染色

（1）70%乙醇固定的细胞悬液，离心，去固定液。

（2）室温条件下加入PI染色一批细胞（10～10细胞/mL），时间为30分钟，然后行流式细胞仪分析。

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（二）吖啶橙染色

1. DNA和RNA的鉴别染色

利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下：

（1）试剂：

1）溶液A：低温保存，稳定期约2周。

Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL 8mL

1mol/L NaCL 15ml蒸馏水76mL，PH 1.5（100mL）

2）溶液B：稳定期数月，最好除菌以后(高压或过滤)贮存。

0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L NaCL 15mL

0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL

蒸馏水24mL，总体积为99mL pH6.0

3）吖啶橙母液：

用吖啶橙/蒸馏水配成1mg/mL(致癌物，应小心)，吖啶橙应用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀释。

4）注意事项：仪器鞘流系统应保持4℃。

氩激光激发波488nm，红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RNA或单链DNA(F>530nm)

（2）方法：

1）用含15%血清的PBS配制细胞悬液，取0.2mL(8×10细胞/mL)，加入0.4mL溶液A，4℃放置45～60秒。

2）加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室温2分钟。

3）应在加入溶液B后10分钟内进流式细胞仪分析。

（3）注意事项：（1）细胞数保持恒定；（2）核酸与吖啶橙的比例；（3）染色时间及温度。 6

2. 单链和双链DNA的鉴别染色

（1）试剂：

1）HBSS内含1000u/mL RNA酶A，0.2mol/L KCl pH1.35

2）吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4缓冲液，

pH2.6。

（2）方法

1）2×10细胞悬于1mL HBSS/RNase液中。

2）37℃温育1小时。

3）将0.2mL细胞悬液(含4×10细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL 0.2mol/L

KCl(pH1.35)混匀，20℃ 30分钟。

4）加2mL吖啶橙染色2分钟。

5）绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA含量。 56

（三）Hoechst33258染色

以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料进行细胞周期分析。

1.试剂：

（1）用培养基配制33 mg/L Brdu及脱氧细胞苷26.4g/mL。

（2）染色液：Hoechst33258溶于PBS，细胞染色24小时后进行分析，据报道染色的稳定时间在30分钟至24小时之间。

2.方法：

（1）将Brdu溶液按1:10加入细胞培养液中。

（2）根据细胞周期时间不同，选择不同时间培养的细胞。

（3）孵育后，摇散细胞以传代培养。

（4）直接用染液重悬细胞，进入流式细胞仪分析。

Hoechst33258荧光值在410～580nm之间，需用330～360nm紫外光激发。应特异性结合腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。因此，不仅特异性标记DNA，亦可标记胸腺嘧啶。在细胞周期分析时，在与细胞孵育过程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态，并在分裂后G1峰的半峰处产生一新峰，此项技术可用于直接测定细胞G2期及分裂时间。

（四）Hoechst33342染色

Hoechst33342染色活细胞DNA

1.试剂：Hoechst 33342,用蒸馏水配成0.25mol/L。

2.方法：

（1）制备10/m细胞悬液，以Hoechst33342染色，浓度为5～10 mg/L ，室温下20分钟。

（2）分析前切勿洗涤细胞。

Hoechst33342可用作细胞DNA的活体染料，据信可在保持细胞活性的同时，呈现出相当好的DNA化学计量关系，激发波在紫外范围350～363nm之间，发射波则在450nm处。

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（五）异硫氰酸荧光素染色

以异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyante，FITC）染色蛋白质。

1.试剂： FITC用含40 mg/L RNase的PBS配成0.1～1.0 mg/L浓度。

2.方法：

(1)染色前用终浓度70%乙醇固定细胞，至少18小时。

(2)离心固定细胞，弃去固定液。

(3)室温下用FIFC染色细胞蛋白，30分钟。

(4)流式细胞仪分析，使用氩激光，激发波长488nm，荧光发射波长515～535nm。 也可于固定细胞中，以18 mg/L (0.1%柠檬酸盐配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分钟以上可对DNA和蛋白质双重染色，分别呈现红色荧光（DNA）和绿色荧光（蛋白质）。

（六）若丹明染色

若丹明标记单克隆抗体的应用

该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞，可用若丹明标记单克隆抗体处理上述细胞；也可用于测定胞浆中的蛋白质(如凋亡BCL-2蛋白，抗病毒蛋白MXA等)。

1.说明：用磷酸盐缓冲液Eagle's MEM稀释FITC连接的抗体内含0.1%叠氮钠、2%牛血清。为判定FITC抗体的最适度的稀释浓度，向微量滴定板的细胞中加入50μL不同浓度的稀释液，再以荧光显微镜确认最佳染色浓度。使用抗人LEU-I抗体分析时，应稀释成5 mg/L或 0.25 mg/L。无论鼠或人细胞在2×10浓度时其存活率应在90%以上。

2.方法：

(1)于微量滴定板加入50μL若丹明标记的抗体，再加入50μL细胞悬液，混匀。

(2)冰浴45分钟，离心滴定板（1500r/min 10分钟）。

(3)弃上清，以培养基100μL洗涤细胞沉淀2次，每次洗涤后用1500r/min 10分钟，弃上清。 7

(4)以1ml预冷的培养基配成1×10细胞/mL的已染色细胞悬液，进样前持续保持冷环境(4℃)。

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（七）光辉霉素和PI的双标记DNA染色

在荧光抗生素光辉霉素和PI联合染色过程中，光辉霉素的供体分子被PI的受体分子接受产生能量转移，该染色技术主要用于实体肿瘤组织，精子细胞及妇科标本，同时也适用于体外培养的细胞。

1.分离制备的细胞悬液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。

2．以PI/光辉霉素染色，4℃ 1小时（PI为10 mg/L、光辉霉素为10 mg/L）。

3．染色后进样，以100W汞灯作为激光光源，使用BG123nm阻断滤片，叠加K590型高通滤法。

（八）PI和FITC对DNA与癌基因探针双标记测定

1. 说明：这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物，然后用PI标记DNA，现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤：

2.方法：

（1）制备白血病细胞悬液，用100%甲醇在-20℃固定10分钟。

(2) 取50μl50 mg/L的癌基因探针Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体，可特异性地直接与N-ras，Ki-ras和Ha-ras三种癌基因编码的21Kd蛋白相结合)，4℃作用30～45分钟。

(3) 用PB离心洗涤2次，重悬浮于50μL HBSS中(含0.1%叠氮钠和2%小牛血清)。

(4) 加入50μL 1:200兔抗鼠IgG，4℃放置30～45分钟。

(5) 同(3)洗涤后加入50μL 1:40的FITC标记的羊抗兔IgG，4℃反应30～45分钟。

(6) 同(3)洗涤后，细胞用RNA酶消化，室温20～30分钟。

(7) 同(3)洗涤后，用PI染液染20分钟。

(8) 同(3)洗涤后，用488nm激发波长测定。FITC染色显示ras癌基因表达产物，

PI染色显示DNA含量。

3. 注意事项：

（1）制备样品时，离心次数不宜过多，防止细胞丢失和凝集；

（2）细胞固定时间不宜过长，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂；

（3）为了降低本底，应将细胞表面未结合的荧光染料洗净；

（4）进行双标记沉淀时，应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。

二、记活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备

流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、

肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。

(一) 原理

活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

(二) 操作步骤

制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)

↓

６7用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10～１×10／ml

↓

取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清

↓4℃ 30min

用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min

↓

弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记

物，充分振摇

↓ 4℃ 30min

用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右，1000rpm×5min

↓

加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)

↓

FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)

(三) 试剂和器材

1.

2.

3.

4. 各种特异性单克隆抗体。 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

(四) 注意事项

1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

附:

1. DPBS (×10, 贮存液)、NaCl 80g、KCl 2g 、蒸馏水加至1000ml，Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释，KH２PO４ 2g

2. 洗涤液：DPBS 900ml、FCS 50ml (终浓度 5％)、4％NaN３ 50ml (终浓度0.2％)

3. 固定液：DPBS 1000ml、葡萄糖20g (终浓度2％)、甲 醛 10ml、NaN３ 0.2g (终浓度0.02％)

（撰稿 金伯泉）