拮抗菌抗菌谱及发酵液拮抗能力测定的新方法

第17卷第1期:55生 物 技 术Vol 17, No 1:55

2007年2月BIOTECHNOLOGY Feb 2007用0. 45 m 的滤膜过滤, 取1. 0mL 滤液进行适当稀释即得到待测液。

HPLC [12]色谱柱(酸柱) :Phnomenex luna C 18柱; 柱温:室温; 流动相:0. 01mol L 磷酸水溶液, p H 2. 5(用Na H 2PO 4调节) ; 流速1mL min; 检测波长:210nm; 进样量:5 L 。对出峰面积进行积分, 按下列标准曲线计算乳酸含量。

y =9 10-9 +5 10-5

式中 =峰面积; y =乳酸含量。1. 3. 3 生物传感仪法

SB A-40C 型生物传感器是以固定化酶为关键单元, 由微电脑控制双指标智能化仪表, 具有2支生物探测电极, 可同时测定同一样品中乳酸和葡萄糖的含量。

用微量进样器吸取适当稀释的发酵液25 L, 按仪器操作要求进样, 20s 后即可同时读取乳酸和葡萄糖(残糖) 含量的测试数据。

酶反应的最适温度和pH 条件下, 酶膜上的乳酸脱氢酶与样品中的乳酸发生特异性的反应, 通过检测酶反应的产物而自动计算得出样品中的乳酸含量。由于乳酸脱氢酶的特异性反应, 因此生物传感仪的乳酸测定结果, 准确性很高, 并已广泛应用于工业发酵、食品分析、环境监测、临床化验和科学研究领域。

从HPLC 的测试中可知, 米根霉发酵液中除了乳酸外, 还含有富马酸, 这些有机酸都可以与碳酸钙反应, 所以EDTA 定钙法测出的数值往往高于实际的乳酸含量, 并且测试结果的误差很大, 本研究中其最大误差达到了11. 58g L 。

在乳酸发酵微生物菌株的育种中, 要求所获得的高产乳酸突变菌株不产生其它的有机酸, 从而提高碳源的利用率和降低后处理成本。因此应选择HPLC 法, 不仅能检测发酵液中乳酸的含量, 还可检测其它有机酸的含量, 从而可为菌种选育和发酵工艺控制提供参考, 以达到尽量提高乳酸产量而避免产生其它有机酸的目的。

生物传感仪测定乳酸的方法简便快速, 专一性强, 结果可靠, 并同时可测定葡萄糖(残糖) 的含量, 加之设备投入较低, 很适合工厂使用。

参考文献:

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2 结果与分析

2. 1 结果

分别采用ED TA 定钙法、HPLC 和生物传感仪对3批次的米根霉菌株RL6041发酵液中的乳酸含量进行了测试, 每个样品测试时, 平行重复3次。对测试数据进行了差异显著性分析, 结果见表1。

表1 不同测试方法测定的米根霉发酵液中的乳酸含量

Table 1 Lactic acid concentration of the broth measured by different methods

测定方法EDTA 定钙法HPLC 法生物传感仪法

乳酸含量(g L)

发酵批次197. 28 6. 41105. 34 2. 81112. 15 1. 05

发酵批次2108. 76 4. 5096. 42 2. 8793. 14 4. 91

发酵批次3129. 11 11. 58100. 79 2. 38101. 07 1. 22

3批次测试结果的差异显著性分析表明, 在同一发酵批次

的乳酸含量测试中, EDTA 定钙法与HPLC 法、生物传感仪法有显著差异(p0. 05) 。比较同一方法对不同批次的测试数据, 发现无显著差异(p>0. 05) , 说明米根霉菌株RL6041的遗传稳定性很好。尽管EDTA 定钙法简便快速, 但重复性差, 平均误差7. 50g L; HPLC 法准确、灵敏, 平均误差2. 69g L; 生物传感仪测定法特异性强, 平均误差2. 39g L 。生物传感仪测定法除具有HPLC 的优点外, 还能同时测定同一样品中葡萄糖(残糖) 的含量。

3 讨论

HPLC 法可以将发酵液中的富马酸、苹果酸以及柠檬酸分离开, 根据标准曲线, 测定出的就是乳酸的含量。在本研究中只检测到了乳酸和富马酸, 其他的几种有机酸均未检出。因此,HPLC 测定发酵液中的乳酸含量, 具有准确性好、灵敏度高的特点。

生物传感仪是将乳酸脱氢酶固定在特殊的膜载体上, 在

拮抗菌抗菌谱及发酵液拮抗能力测定的新方法

李小俊, 成丽霞, 吴彦彬, 边艳青

(河北师范大学生命科学学院, 河北石家庄050016)

摘要:目的:确定测定拮抗细菌枯草芽孢杆菌A 的抗菌谱及发酵液拮抗能力的方法。方法:平板对峙法测定抗菌谱, 三明治法、管碟法、滤纸片法和双层打孔法测定发酵液的拮抗能力。结果:用点接拮抗细菌单菌落的平板对峙法测得菌株A 对玉米小斑病菌等10种病原真菌均有拮抗作用; 用双层打孔法测定菌株A 发酵液拮抗能力, 发现在培养条件为温度32! , 溶氧量为300mL 三角瓶培养基装量为30mL, 接种量5%, 初始pH 值7. 5时发酵液拮抗能力最强。结论:点接拮抗细菌单菌落的平板对峙法适合用来测定菌株A 的抗菌谱, 双层打孔法适合用来测定菌株A 发酵液的拮抗能力。

关键词:拮抗细菌; 拮抗能力; 枯草芽孢杆菌; 抗菌谱

中图分类号:Q935 Q819文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2007)01-0055-04

New Methods of Testing Fermentation Liquid Antagonistic Effect of

Antagonistic Bacteria and Antimicrobial Spectrum

LI Xiao-jun, C HENG Li-xia, WU Yan-bin, BI AN Yan-qing

56 生 物 技 术 第17卷第1期Abstract :Objective :To ascertain methods of testing inhibitory spectrum and antagoni stic effect of fermentation liquid of the Bacillus subtilis A. Methods :Flat-stand method was used to ascertain inhibi tory spectrum, Sand wich method, cup-plate method, fil ter paper method and double deck-stiletto method were used to testing it ∀s antagonistic effect of fermentati on liquid. Results :The s train A showed antimicrobial effect to ten fungal pathogens including Bip olaris maydis using the method of flat-stand with i noculating single colony of antagonistic bacteria. Using double deck-stiletto method to testing strain A ∀s antagonistic effect of fermentation liquid , we discovered that it had the strongest antagonistia effect in the condition of temperature 32! , quantity of dissolving oxygen 30 300, quantity of inoculating 5%and primary pH 7. 5. Conclusion :It is con fi rmed that flat-stand method wi th inoculating single colony was a good way used to test inhibitory spectru m, double deck-s tiletto method was a good way used to tes t antagoni stic effect of fermentation liquid of strain A.

Key words :antagonistic bacteria; antagonis tic effect; Bacillus subtilis ; antimicrobial spectrum 生物防治在可持续农业的发展中发挥着越来越重要的作用。生物防治的一个重要内容就是利用微生物来防治病害。用来防治植物真菌病害的有益微生物主要包括四大类:细菌[1-3], 放线菌[4]、木霉[5]、酵母菌[6,7]。细菌中研究较多的是芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌[8-11]。本研究在确定拮抗细菌枯草芽孢杆菌A 的抗菌谱和液体发酵条件过程中, 一个重要的实验内容就是采用合适的方法测定该菌株的拮抗能力。文献报道的测定拮抗能力的方法很多, 有平板对峙法、三明治法、滤纸片法、管碟法等, 而且各种方法的适用范围也不一样, 各有其特点。本实验通过采用上述方法测定菌株A 的拮抗能力, 总结了各方法的优缺点, 并对以上方法进行的改良, 最终确定了测定抗菌谱的方法, 并且摸索出一种测定拮抗细菌发酵液拮抗能力的新方法。而且此方法简便快捷, 在相关的文献中没有报道, 为优化拮抗细菌液体发酵条件过程中发酵液拮抗能力的测定提供了一个好方法。

平皿25mL 为宜) 为下层; 上层为真菌孢子悬液与PDA 培养基的混合液(30mL 为宜) , 或者直接倒一层PDA 培养基(30mL 为宜) , 待PDA 冷却后再将真菌孢子涂布在上面; 然后在上层培养基上用一根直径为6m m 的玻璃管打孔, 孔中加入拮抗细菌发酵液, 培养后测量抑菌斑的直径。

2 结果与分析

2. 1 抗菌谱测定结果

采用PDA 平板中央采用牙签点接拮抗细菌单菌落, 距拮抗细菌四周2cm 处接种直径为6mm 的病原真菌菌块, 以平板中央不接种拮抗细菌为对照, 待对照长满平板时, 统计实验结果, 结果统计方法参考文献[13], 每种病原真菌做3个重复。

利用此种方法测定本实验室分离到的拮抗细菌枯草芽孢杆菌A 的抗菌谱, 结果如表1。从表1可以看出, 该菌株对烟草赤星等10种病原真菌均有拮抗作用, 其中对玉米小斑病菌c 小种、黄瓜炭疽和大蒜菌核的拮抗能力最强, R2 R1值分别为2. 8575、2. 3780和1. 9536, 其次对棉花黄萎、棉花枯萎、稻瘟菌、辣椒炭疽和烟草赤星均有较强的拮抗作用。

表1 枯草芽孢杆菌A 对10种植物病原真菌的拮抗作用

Table 1 Antagonistic effect to ten fungal pathogens of Bacillus subtilis A 植物病原真菌烟草赤星黄瓜炭疽辣椒疫霉稻瘟菌大蒜菌核棉花枯萎

玉米小斑病菌c 小种小麦赤霉辣椒炭疽棉花黄萎

R2 R10. 83492. 37800. 339611. 95361. 32. 85750. 3030. 86671. 358

拮抗能力大小+++++++++++++

1 材料和方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验材料:拮抗细菌:枯草芽孢杆菌A (Bacillus subti lis ) , 本实验室分离、鉴定和保存。病原真菌:烟草赤星病菌(Alterna ria a lternate ) 、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum lagena rium ) 等10种病原真菌, 均为本实验室保存。

1. 1. 2 试剂:琼脂粉购自河北省博海生物工程有限公司, 酵母膏购自北京奥博星生物技术责任有限公司, 其他试剂均为国产分析纯试剂。

1. 1. 3 主要仪器:超净工作台, 苏州安泰空气技术有限公司; 生化培养箱, 恒温振荡器, 均为哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。

1. 1. 4 培养基:PDA 培养基, 参考文献[12]。TSA 培养基:胰蛋白胨15g, 大豆蛋白胨5g, NaCl 5g, p H 7. 3, 水1000m L 。1. 2 方法

1. 2. 1 抗菌谱的测定

采用平板对峙法, 具体方法既可以在PDA 平板中央接种病原真菌, 四周接种拮抗细菌, 参考文献[13]; 也可在中央接种拮抗细菌, 四周接种病原真菌, 参考文献[14]。1. 2. 2 发酵液拮抗能力的测定

1. 2. 2. 1 三明治法:即两层PDA 培养基之间为一层PDA 培养基和拮抗菌的混合液, 待凝固后在上层PDA 中央接种一块直径为6mm 的病原真菌, 参考文献[15]。

1. 2. 2. 2 滤纸片法:在待检测平板上接上蘸有拮抗细菌发酵液的滤纸片。参考文献[16]。

1. 2. 2. 3 管碟法:管碟法即在待检测平板上加上牛津杯, 简易的管碟法可直接在待检测平板上打孔, 牛津杯内和孔中可加入拮抗细菌发酵液, 参考文献[17, 18]。1. 2. 2. 4 双层打孔法

先在平皿底部倒入一薄层PDA 培养基(直径为15cm 的大

收稿日期:2006-09-07; 修回日期:2006-11-28

基金项目:河北省科学技术研究与发展计划项目资助(05547002D-5) 作者简介:李小俊(1981-) , 女, 在读硕士, 专业方向:应用微生物, 研究方向为生物防治, E-mail:xiaoj unws w @sina. com; *通讯作者:边艳青, 女, 副教授, Tel:0311-86268283, E -mail:bianyanqing151@s ohu. co m R2:抑菌带宽度; R1:拮抗细菌菌落半径; ++:R2 R1>1. 5; +:0

R2:Width of anti microbial cingul um; R1:Colony radi us of antagonis tic bacteria.

图1和图2是枯草芽孢杆菌A 对玉米小斑病菌c 小种和黄瓜炭疽的拮抗作用图。从图中可以看出, 对照PDA 平板中, 由于平板中央没有接种拮抗细菌, 平板上接种的4块病原真菌已经长得连接在一起, 覆盖了整个平板; 而平板中央接种了了拮抗细菌单菌落的平板能明显看到平板中央接种的拮抗细菌生长形成了一个较小的菌落, 菌落四周与病原真菌对峙的地方有明显抑菌带。

利用此种方法, 测定了经紫外诱变后的菌株A 的拮抗能力。结果如图4。可以看出平板中央浅黄色区域为牙签点接的拮抗细菌生长形成的菌落, 四周黑色区域为真菌菌块生长连在一起, 而且经紫外诱变后, 抑菌带R2明显比未诱变之前宽。R2 R1能达到5. 363, 拮抗能力有了很大的提高。

从以上实验结果可以看出, 用牙签点接拮抗细菌单菌落的平板对峙法比较简便, 适合于抗菌谱的测定和拮抗细菌的筛选。牙签点接拮抗细菌, 接种量很小, 拮抗菌容易长成一个较小、较规则的单菌落, 并且四周抑菌带明显。一个较小的缺点是培养周期较长, 不同的病原真菌所需时间不一样, 一般37d

2007年2月 拮抗菌抗菌谱及发酵液拮抗能力测定的新方法 57

力。采用牛津杯加样, 由于加样量小, 所加样不能覆盖牛津杯

底, 因此本实验采用简易的管碟法, 直接在PDA 平板上打孔加样, 实验发现在打孔的过程中, 孔内培养基不容易取出, 一个平板上所打的各孔底部不平, 高度不一, 导致有的孔所加样溢出, 影响实验结果。

2. 2. 4 双层打孔法:是对简易管碟法的一个改进, 在相关文献中还没有报道。是本实验室改进的一个新方法。本实验在优化菌株A 的培养条件过程中采用此方法测定其发酵液的拮抗能力, 每个培养条件组合各做3个重复, 测量抑菌斑直径, 取3组平均值。培养条件优化设计方案及不同培养条件下发酵液抑菌斑直径如表2和图4。从图4可以看出, 不同培养条件下发酵液抑菌斑直径大小不一, 其中E 条件组合发酵液拮抗能力最强, 抑菌斑直径达到2. 41cm, 即最优培养条件为:温度32! , 溶氧量为300mL 三角瓶培养基装量为30mL, 接种量5%, 初始p H 值7. 5。从图4中还可以看出用此种方法测得的结果标准偏差较小。

图5为用双层打孔测定发酵液拮抗能力结果。图5-B 中8个孔中所加发酵液为不同培养条件下的发酵液, 经培养后可以看到, 图中大面积浅灰色区域为病原真菌孢子繁殖形成的菌落, 8个白色圆形区域为8个孔中的拮抗细菌发酵液生长形成的菌落, 其周围黑色区域为拮抗细菌抑制病原真菌菌丝生长, 真菌菌丝溶解形成的抑菌斑, 可以看到各孔周围抑菌斑直径大小不一, 通过抑菌斑的大小就可以判断培养条件的好坏。而图5-A 对照孔中加入的无菌水没有拮抗能力, 真菌菌丝长满整个平板。

从以上结果可以看出本实验室创新的新方法双层打孔法, 适用于测定拮抗细菌发酵液的拮抗能力。此法操作简便, 而且由于是双层平板, 打孔时只在上层打孔, 这样在一个平板中所打各孔底部水平一致, 高度一致, 减小了实验误差。此外实验周期短, 一般1~2d 就出结果。

表2 菌株A 培养条件优化方案及各培养条件下发酵液抑菌斑直径Table 2 Cul ture condition opti mization of s train A and diameter of antibi osi s fleck under different culture condi ti on

图3 诱变后菌株A 对玉米小斑病菌的拮抗作用

Fi g. 3 Antibi osi s to Bipolaris maydis of strain A after ultra-vi olet mutation

不同条件组合

A B C D E F G H

培养温度溶氧量接种量(! ) (装量ml ml 瓶) (%)

[**************]2

50 30040 30030 30060 30030 30060 30050 30040 300

5%

110. 55330. 5

初始pH 值

8. 07. 07. 56. 57. 56. 57. 08. 0

图1 菌株A 对玉米小斑病菌c 小种的拮抗作用

A:对照, 平板中央未接种菌株A 单菌落; B:平板中央接种菌株A 的单菌落。

Fi g. 1 Antagonistic effec t to Bipolaris maydis of s train A

A:Control, nonbacteriz ed PD A plate with colony of s train A in the middle; B:bacterzied.

图2 菌株A 对黄瓜炭疽的拮抗作用

A:对照; B:平板中央接种菌株A 的单菌落。

Fi g. 2 Antibi osi s to Colletotrichum lagenarium of s train A A:Control, nonbac terize; B:bacterzi

e.

图4 不同培养条件发酵液拮抗能力

Fi g. 4 Antagonis tic effect of fermentation liquid under different culture condi tion

2. 2 发酵液拮抗能力的测定

2. 2. 1 三明治法:可用于测定拮抗细菌发酵液的拮抗能力, 但缺点是中间拮抗细菌菌液与PDA 培养基不易混合均匀, 而且在培养过程中拮抗细菌由中间层长到培养基表面, 使得处理组真菌菌块生长得极不规则, 不容易测量其菌落直径。

2. 2. 2 滤纸片法:也是用来测定发酵液拮抗能力的方法, 但缺点是滤纸片蘸取拮抗细菌发酵液后, 在然后风干的过程中容易染菌, 且操作繁琐。

2. 2. 3 管碟法:常用于抗生素效价的测定, 由于拮抗细菌也, 图5 双层打孔法测定不同发酵液拮抗能力

A:对照, 孔中加无菌水; B:孔中加不同发酵条件下发酵液。

Fig. 5 Antagonis tic effects of different fermentati on liquid with me thod of dou ble deck-stiletto

A:Control with s terile water in the hole; B:wi th fermentation liquid of different

第17卷第1期:58生 物 技 术Vol 17, No 1:58

2007年2月BIOTECHNOLOGY Feb 2007

3 讨论

采用用牙签点接单菌落的平板对峙法测出枯草芽孢杆菌A 对玉米小斑病菌等10种植物病原真菌均有拮抗作用。采用本实验室创新的双层打孔法测定不同培养条件下发酵液拮抗能力, 发现在温度32! 、溶氧量为300m L 三角瓶培养基装量为30mL, 接种量5%, 初始p H 值7. 5时发酵液拮抗能力最强, 抑菌斑直径达到2. 41cm 。

以上几种方法在不同的文献中都有报道, 但是各法的适用范围不一样, 平板对峙法适用于拮抗谱的测定和拮抗菌的筛选, 不仅适用于拮抗细菌, 对于有拮抗能力的放线菌、酵母菌、木霉也适用。本实验发现用牙签点接拮抗细菌单菌落的平板对峙法是测定拮抗细菌拮抗谱的简便方法。双层打孔法, 是本实验室对管碟法改进后创立的一种新方法, 由于是在双层平板的上层打孔, 因此命名为双层打孔法。实验发现这是一种测定拮抗细菌发酵液拮抗能力的简便快捷的新方法。

以上这些方法主要是用来测定一些产物为可溶解性拮抗物质的拮抗细菌的拮抗能力, 除此以外, 还有相关文献报道, 拮抗细菌的拮抗能力可能和细菌分泌一些有挥发性的拮抗物质有关, 如Bhaskar Chaursia 报道一株拮抗枯草芽孢杆菌所分泌的可溶解性物质和挥发性物质均具有拮抗活性。测定产物为挥发性拮抗物质的拮抗细菌的拮抗能力可先将拮抗细菌接种于细菌培养基, 培养24h 后备用; 将一块直径为6mm 的病原真菌接种到PDA 培养基上, 然后将此平皿倒扣于培养24h 后的接种了拮抗细菌的平皿上面, 以不接种拮抗细菌为对照, 培养后计算抑制率。

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蚕豆根尖细胞微核技术检测合成氨工业水的遗传毒性

(长治学院生化系, 山西长治046011)

摘要:目的:探讨了合成氨工业水处理前后对蚕豆根尖细胞微核率的影响。方法:选取某化工厂生产流程中3个有代表性的水样, 同时以蒸馏水(C K) 为阴性对照, 以不同浓度(0. 5、5、50、500 g L) 的环磷酰胺处理为阳性对照, 共5个处理组水平, 蚕豆根尖细胞微核试验测定其MCN #。结果:洗煤气水、洗甲醇水可诱导蚕豆根尖细胞产生较高的MCN #与对照组相比, 差异均具有统计学意义(P

关键词:蚕豆; 微核技术; 合成氨工业水; 遗传毒性

中图分类号:X832. 02 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2007) 01-0058-03

刘瑞祥, 齐永平, 吕敏

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Study on Detecting the Genetic Toxicity of Synthesis Ammonia Industrial Waste by

V icia faba Root -tip Cell Micronucleus Technique

Abstract :Objective :Effect of un treated and treated synthesis ammonia industry waste on Vicia -micronucleus rate was discussed. Methods :Three waste samples of product flow in a chemical plant were selected; the di stilled water was regarded as negative comparison; and at the same time, the cyclophosphamide(CP) with different concentration of 0. 5, 5, 50, 500 g L as disposed regent was regarded as posi tive comparison. There are five group levels in all in this experiment, which MC N %was determined by usi ng Vicia -micronucleus test. Results :The results showed washing gas water and washing methanol water could induce the higher MCN%of Vicia f aba root tip cells contract wi th comparision groups, the difference had the statistical sense (p

蚕豆根尖细胞微核检测技术(Vicia f aba M icronucleus Test ing, VMT ) 是利用蚕豆初生根尖对诱导物反应敏感的特点, 以其灵敏度高, 细胞周期短, 可靠性和实用性强, 本底较低, 有明显的剂量-效应关系等优点被广泛应用于水质污染和致突变物的检测[1,2]。1986年, 国家环保局将蚕豆根尖微核技术列入

(Department of Bi oche mis try, Changzhi Universi ty, Changzhi 046011, China)

LI U Rui-xiang, QI Yong-ping , LV Min

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收稿日期:2006-10-25; 修回日期:2006-11-13

基金项目:山西省高校科技开发基金项目资助(200383)

作者简介:刘瑞祥(1964-), 男, 副教授, 从事遗传学和遗传毒理学方面的教研工作, 主持、参加省级项目4项, 发表论文35篇, 参编著作2部; *