实验一:米氏常数的测定
双倒数法测定过氧化物酶的米氏常数
学院/专业/班级____________________________________________ 姓名_______________ 合作者___________________________________________________ 教师评定___________
【实验目的】以过氧化物酶为例,掌握测定酶促反应初速率和米氏常数的原理及方法
【实验原理】1913年,Michaelis 和Menten 运用酶反应过程中形成中间络合物的原理,首先提出了底物浓度和酶促反应速率的关系式,即著名的米氏方程:
v =V max ⋅[S ] 式中:v 为反应初速率(微摩尔浓度变化/min);V max 为最大反应速率(微摩K m +S 尔浓度变化/min);[S ]为底物浓度(mol/L);K m 为米氏常数(mol/L)。这个方程式表明当已知K m 及V max 时,酶反应速率与底物浓度之间的定量关系。K m 值等于酶促反应速率达到最大反应速率一半时所对应的底物浓度,是酶的特征常数之一。不同酶的K m 值不同,同一种酶与不同底物反应K m 值也不同,K m 值可以近似的反应酶与底物的亲和力大小:K m 越大表明亲和力越小;K m 越小表明亲和力越大。大多数纯酶的K m 值在0.01~100 mmol/L。通过米氏方程的不同变形,可有多种求算米氏常数的方法,一般较常用的双倒数法,即取米氏方程的倒数式:1K m 111111=⋅+=以对作图得一直线,该直线与横轴截距-。 v V max S V max S K m v S 过氧化物酶是一种对氢受体(H 2O 2) 底物有特异性,对氢供体底物缺乏特异性的酶,它可催化过氧化氢氧化许多多元酚或多元胺类底物发生显色、荧光或化学发光反应,可用于微量过氧化氢含量测定,也可以和其它酶反应系统偶联可用于测定许多与生命相关的物质:如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及胆甾醇等,亦是免疫分子和核酸分析中常用的标记物。通常使用的过氧化物酶是从植物辣根中提取的,因此也称为辣根过氧化物酶(horseradish
peroxidase, HRP)。HRP 属于含血红素蛋白的一种,是由辅基——氯化血红素(铁卟啉)和脱辅基蛋白(糖蛋白)组成,分子量为44000。
HRP 是双底物酶(过氧化氢+多元酚或胺类底物),为求其对某一底物的K m ,通常的做法是令另一底物的浓度相对于待测底物大大过量,即可把该酶促反应当作单底物反应来处理。本实验我们选用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB )作为氢受体,它可被Hb 催化过氧化氢氧化生成有色产物,该产物在反应条件下(pH5-7左右)为蓝色物质(λmax =650 nm)。实验中我们使TMB 的浓度大过量,测定HRP 对H 2O 2的K m 值(反之亦可测定HRP 对TMB 的K m 值)。
【实验仪器及试剂】
仪器:日立 UV-3010紫外可见分光光度计;石英比色皿(1 cm):2只;100 μL 微量取样器1支(枪头若干);1 mL取液器一支;电磁搅拌器1台(1 cm聚四氟乙烯搅拌子1个 )
试剂:过氧化物酶(HRP 溶液: mol/L;3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液(TMB ): mol/L(DMSO 溶液);H 2O 2溶液: mol/L;磷酸缓冲液(PBS ):pH= ; mol/L
【实验步骤】
在1 cm的比色皿(内置搅拌子)中加入1.7 mL PBS,然后在搅拌下,依次加入100 μL HRP、TMB 和不同量的H 2O 2溶液,马上移入样品架,记录650 nm处吸收峰强度随时间变化的曲线。(参比:1.7 mL PBS+100 μL HRP+100 μL TMB)
【数据记录与处理】
温度:______
【注意事项】 H 2O 2应该配置成不同浓度,加入相同体积为佳,但是由于动力学测定本身误差较大,且H 2O 2本身体积所占比例不大,故采取上述步骤。
【思考题】
1. 可查阅天然的过氧化物酶对H 2O 2的K m 并与测定值进行比较
2. 初速率的测定应注意什么问题?本实验中初速率的单位为A (吸光度)/s(秒)与米氏方程中的单位并不相同,为什么不影响k m 的测定?如需测定V max ,应如何进行?
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