痕量微生物快速检测技术_毛佳文

痕量微生物快速检测技术

毛佳文，李

抄，陈

锋，顾

彪，杨子健，吴太虎

［摘要］痕量微生物快速检测技术结合流式细胞术和图像细胞术的功能，能够实现细胞微生物的快速检测、荧光信号量化与微生物形态的可视化，其对微生物的快速准确计数，在食品、饮用水等的质量安全检测中可以发挥重要作用，对于保证居民日常生活及身体健康具有重要实际意义。该文介绍了当前几种常用的微生物检测方法，重点阐述了痕量并对该技术在微生物检测方面的应用前景及发展趋势进行了展望。微生物快速检测技术的应用及优缺点，

［关键词］微生物检测；激光扫描；应用领域；优缺点［中图分类号］Ｒ446．5

［9960（2015）04-0316-03文章编号］1674-［文献标志码］A

DOI：10．7644/j．issn．1674-9960．2015．04．019

Technologyforrapiddetectionoftracemicrobes

MAOJia-wen，LIChao，CHENFeng，GUBiao，YANGZi-jian，WUTai-hu*

（InstituteofMedicalEquipment，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Tianjin300161，China）

*Correspondingauthor，E-mail：wutaihu@vip．sina．com

［Abstract］Technologyforrapiddetectionoftracemicrobescombinedwithflowcytometryandimagecytometryisusedforrapiddetectionofcellsandmicroorganisms，quantificationoffluorescentsignals，andvisualizationofcellsandmicrobes．Itsfastandaccuratecountofmicroorganismsplaysanimportantroleindetectionofthequantityoffoodandwater，andcanhelptoimproveresidents'qualityoflifeandhealth．Thisarticledescribesseveralcommonmethodsfordetectingmicroorganismswithemphasisontheiradvantagesanddisadvantages．Currentapplicationsandfuturedeveloplmentsarealsodiscussed．［Keywords］microbialdetection；laserscanning；application；advantagesanddisadvantages现代社会，由于农、兽药残留，有机污染物污染，食品添食品安全问题层出不穷，加剂以及生物污染等引起的水质、

导致饮用水、食品等质量安全问题成为社会各界关注的焦点，而致病菌导致的饮用水、食品安全问题更是引起人们广泛关注，如何实现对水及食物中致病菌的快速检测计数，对于保障居民日常生活及身体健康具有重大意义。

当前的微生物检测技术主要有经典的平板培养计数法和流式细胞术。平板计数法计数准确，可靠度高，成本低，但检测速度慢，不能满足特定场合的限期因需进行细菌培养，

要求，而且细菌培养需要专业技术操作，还不能做到普及。流式细胞术是将标本预处理制成单细胞悬浮液，再进行具有特异性的、化学定量关系的染色后，自动或手动进入流动室，通过激光激发，测定散射光和荧光，实现细菌的检测。流式多参数检测的优点，但要求被测物浓度细胞术具有速度快、

在几百到几千数量级，无法正确测定痕量微生物。针对以上微生物检测中存在的不足之处，已发展了一种检测方法，即痕量微生物快速检测技术，可以实现对痕量微生物的快速实时检测。

1痕量微生物快速检测技术简介

痕量微生物快速检测技术是通过对样本前处理（荧光

染料染色），而后在荧光成像的基础上结合激光扫描装置，通过使用特定波长激光激发样本中标记的荧光染料，采集并处理荧光信号，进而计数滤膜上的细胞微生物数量，检测和观察细胞微生物的结构以及内部分子、离子运动情况

［1］

。其

对微生物的检测，可以获得与平板计数法一致的检测结果，但所需时间仅仅是十几分钟。同时，在比微量更少的痕量微生物检测方面，可以实现对＜10CFU/g的食物或＜10CFU/ml的液体样品的检测，检测精度高。目前，痕量微生物快速检测技术已应用于食物、水中细菌快速检测，各种特异蛋白结合其他相关生物技术，在形态学、生理动态变化过程研究，

病理学、免疫学、遗传学等领域得到了广泛应用。学、2

痕量微生物快速检测技术的应用

痕量微生物快速检测技术的应用大致可以分为3类：①检测计数水、食物等样本中微生物数量，评价水及食物的质量。既可以实现细菌总数的快速测定，也可实现对特定细如菌的快速计数。②微环境及临床样本中检测特定靶生物，嗜肺军团菌，造血祖细胞中CD34（高度糖基化的i型跨膜糖蛋白），这类检测通常需要探针进行选择性标记。③研究细胞、微生物等的病理生理状态，如观察细胞周期分裂，细胞凋

［E-mail：作者简介］毛佳文，男，硕士研究生，研究方向：智能仪器，

949989204@qq．com［作者单位］军事医学科学院卫生装备研究所，天津300161［E-mail：wutaihu@vip．sina．com通讯作者］吴太虎，

亡，钙离子运动过程等。2．12．1．1

检测计数水和食物中微生物数量测定细菌总数

国外先后应用痕量微生物快速检测

球蛋白重链结合蛋白在某些肿瘤中呈高表达）在食管癌各GＲP78在正常食管中级病变中的表达情况，分析结果显示，阳性率为0%；在食管中度、重度不典型增生和原位癌中较强表达，阳性率分别为90．4%和83．3%；在食管鳞癌的阳性GＲP78在食管正常细胞向恶性细率为47．4%。因此认为，

胞转化的过程中可能扮演了重要角色。对造血祖细胞中CD34（高度糖基化的i型跨膜糖蛋白）表达进行评估，可以区分原始幼稚细胞与正常成熟细反映造血祖细胞的特征，

胞，判断的依据是CD34随细胞的成长逐渐消失2．3

研究细胞、微生物等的病理生理状态

通过对细胞DNA含量分析，根据细胞周期是否出现非或虽未出现明显的异倍体，但细胞周期中整倍体细胞峰，

G0、G1、S和G2等各期的DNA含量比例出现异常，可较为准描绘肿瘤特征，监控肿瘤细胞增殖过程。确地判定是否癌变，赵世光等

［10］

［9］

技术对饮用水中的细菌总数进行快速、直接的镜检计数。吖AODC），啶橙染色直接计数（acridineorangecounts，水样采集迅速加入浓度为2%的甲醛固定，取10ml水样加入后，

0．5ml0．2%吖啶橙染色1～2min；将染色水样经滤膜过滤用激光扫描细胞仪计数视野中发橙色或绿后置于载玻片上，

色荧光的菌体。BacLight染色直接计数，取2ml水样品，加避光培养15～20min，入60μl配制的SYT09/PI染色试剂，

然后用激光扫描细胞仪观察视野中发红色或绿色的菌体

［2］

。

。SYT09可以快速穿透任何细胞壁与DNA结合，PI则

对完整细胞壁不能穿透，但其透过不完整细胞壁与DNA有在死细胞中将代替SYT09与DNA结合。在氩更大亲和力，

SYT09呈明亮绿色荧光，表征活菌；PI激光（488nm）激发下，呈红色荧光，表征死菌2．1．2

计数活菌数量

［2］

用痕量微生物快速检测技术分析脑肿瘤细胞的

。DNA指数和增殖指数，以反映肿瘤的恶性程度，对手术中决定胶质瘤切除面积都有一定临床应用价值。还可用于研究比较基因组学杂交，在几种类型人类肿瘤中揭示遗传学异常

［11，12］

痕量微生物快速检测技术应用于活

DVC）。向样本中加入菌直接计数（directviablecounts，

0．002%萘啶酸（nalidixicacid）和0．025%酵母膏，25℃避光，培养，然后用甲醛固定，用激光扫描细胞仪扫描计数，视野中长大或变粗的菌体被认为是活菌。萘啶酸可以抑制细菌DNA的复制，但不影响细胞中其他合成途径的继续运转，在一定浓度营养物存在下，菌体伸长、变大。但是因为部分革低浓度的萘啶酸不能抑制兰阳性及阴性菌对萘啶酸有抗性，它们的繁殖，致使计数结果会出现偏差2．1．3的检测

［4］

。痕量微生物快速检测技术应用于临床病理学，可

以探索疾病的发病机制，对预后和指导临床治疗方案有重大意义。3

痕量微生物快速检测技术的优缺点

在实际应用中，针对痕量微生物检测，传统的检测方法有时需要耗费数天，并可能导致计数结果偏低。痕量微生物快速检测技术相对于其他常用的微生物细胞分析方法，如最近似数测定法、平板计数法等，在检测痕量微生物时精度高，而且因不需要对样本液进行培养，检测所需时间仅为十几分钟。在对样本的检测中，痕量微生物快速检测技术可以实现1min扫描5000个细菌，且3min能扫描完直径为25mm的滤膜，因此可以用于细菌的快速检测、食品水质质量问题的早期发现、实时监控和疾病的诊断与疗效评定

［13］

。

痕量微

计数食物、水中食源性大肠杆菌0157∶H7

［5］

生物快速检测技术用于食物及饮用水中大肠杆菌O157∶H7

：通过结合使用免疫磁性分离技术（IMS）和四唑氯

化物（CTC）测定大肠杆菌数量，实现细菌的计数。在食物测先把食物裂解后，用无菌水稀释溶解，然后把带有定中，

O157特异性抗体的磁珠与水溶液混合孵化，让特异性抗体与大肠杆菌结合，通过磁珠分离技术获得含有磁珠的O157∶H7大肠杆菌，再用CTC进行染色后，通过激光扫描细胞仪进行扫描计数，测定大肠杆菌数量。2．1．4

计数沙门菌属细菌

沙门菌属是一类重要的人畜共

患病原菌，能导致鸡白痢、鸡伤寒等多种动物疾病，对人身体健康及畜牧业健康发展等有重大影响。有研究者利用痕量微生物快速检测技术，通过表面吸附将样品吸附于载玻璃页而后激光扫描细胞仪进行结果测定，实现面的一种薄膜上，

了对沙门菌属的测定，其检测结果不会出现假阴性或假阳性反应，准确率高2．1．5

［6］

。

痕量微生物快速检测技术可以实现荧光信号量化、二维图像可视化，可以对样本重复染色、多次分析。形态可视化可用于观察细胞的动态变化、离子、糖蛋白等的输运情况，对于研究细胞间通讯情况具有重要意义。痕量微生物快速检测技术具有宽的动态测量范围，理论上只要滤膜上有一个细菌，就可以检测到，可以用于痕量微生物浓度情况下的检测；同时，在高污染样本中也可精确检测，当滤膜上细菌数量达

［14］

到10000个时，仍可进行检测计数。在对贴壁细胞的检

。

Ｒiepl等［7］利用13

测中，不会破坏细胞的形态结构，虽然因不能检测侧向散射光，不能区分单核细胞、粒细胞和淋巴细胞，但痕量微生物快速检测技术对于不能重复离心的样本，检测具有优势，且样本分析较流式细胞术价格低，所需试剂仅是流式细胞术的20%［15］。

目前，此检测方法还存在一些局限性。首先，没有兼容性强的荧光染料，若激光扫描细胞仪只配备一个氩离子激光器，只能选激发波长约为488nm的荧光染料，其激发出的荧光光谱在500～530nm；其次，由于需要对样本过滤，只能选

［8］

实时评估医院透析用水的质量

份来自医院的透析用水，分别用不同的方法测试，包括活菌TVC）法和痕量微生物快速计全面计数（totalviablecounts，

数法，并与平板计数法（HPC）进行比较，证明痕量微生物快速检测方法与HPC具有高度相关性，尤其适用于需要快速检测的场合，能够实现对透析用水的实时快速检测，对于确保透析用水的质量安全具有重要意义。2．2

样本中靶生物的探测

对细胞内的特异性球蛋白的标记检测，李伟等

用痕

微生物浓度相对较低的样本过滤，或者先对样本进行预处理，但这样会对样本造成一些损害，且降低了检测速度；在荧

量微生物快速检测技术分析GＲP78（葡萄糖调节蛋白、免疫

光原位杂交技术和免疫荧光技术中，荧光强度一般较低，虽然有些研究中提到了用双标记法标记，增加荧光强度，但难免使得样本前处理更加复杂。同时，激光扫描细胞仪价格也Chemscan需17万欧元，Thorlab比较昂贵，现有国外仪器中，需20万美元，且都是低端配置，而对每个样本检测分析时，仍需花费约7．5欧元。4

总结与展望

本文对痕量微生物快速检测技术的原理、应用、优缺点进行了阐述，重点介绍了痕量微生物快速检测技术在食物、水中细菌计数研究中的应用，其检测速度快、灵敏度高、操作简单、图像可视化的特点，在食品、空气及水质安全检测中应用前景广阔。痕量微生物快速检测技术将来的发展趋势，总体来说，有3个方面：①前处理样本的自动化，这将缩短样本处理时间，简化人工操作，节约成本；②免疫细胞化学探针的发展，实现荧光标记物多样化，而这又取决于细胞生物学、生物技术及医药领域方面的进步；③多通道激光源和多重荧光染色技术的发展，这将会扩展其应用范围，提高其适应复杂环境的能力。这3方面的发展将会使该项技术在实际应用中发挥重大作用，为其更深入的发展和应用奠定稳固的基石。【参考文献】

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编辑

2014－11－14

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（孙承媛

编辑

2014－08－20

收稿）