脂肪酶(LPS)活性试剂盒使用说明

脂肪酶（LPS）活性试剂盒使用说明

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

货号：BC2345

规格：100/96S

产品内容：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1瓶，室温保存。

试剂三：液体×1瓶，4℃保存。

标准品：液体×1瓶，10µmol/mL的标准溶液，室温保存。临用前加入3.168mL 甲苯，充分溶解。

产品说明：

LPS 又称甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油（或者甘油二酯和单酯）。LPS 广泛的存在于各种生物中。血清中LPS 的异常增高常见于胰腺炎和胰腺癌。

LPS 催化油酯水解成脂肪酸，利用铜皂法测定脂肪酸生成速率，即可计算LPS 活性。自备仪器和用品：

研钵、台式离心机、震荡混匀器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g

组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。16000rpm，4℃离心40min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后16000rpm，4℃离心40min，取上清置冰上待测。

3. 血清等液体：直接检测。

二、LPS测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到710nm，蒸馏水调零。

2. 试剂一和试剂二置于37℃水浴预热30min 以上。

3. 空白管：取1.5mL 离心管，依次加入130μL试剂一50μL试剂二和20μL 蒸馏水，置于37℃震荡反应10min；加入300μL甲苯，反复震荡混匀10min，25℃，4000rpm离心10min；小心吸取上层溶液200μL，加入1.5mL 离心管中，再加50μL试剂三，反复震荡5min；25℃，4000rpm离心10min，小心吸取上层溶液150μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm 处测定吸光值。记为A 空白管。

4. 测定管：取1.5mL 离心管，依次加入130μL试剂一50μL试剂二和20μL 上清液，置于37℃震荡反应10min；加入300μL甲苯，反复震荡混匀10min，25℃，4000rpm离心10min；小心吸取上层溶液200μL，加入1.5mL 离心管中，再加50μL试剂三，反复震荡5min；25℃，4000rpm离心10min，小心吸取上层溶液200μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm 处测定吸光值。记为A 测定管。

5. 标准管：取标准品200μL，加入1.5mL 离心管中，再加50μL试剂三，反复

震荡5min；25℃，4000rpm离心10min，小心吸取上层溶液150μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm 处测定吸光值。记为A 标准管。

三、LPS活性计算公式：

A.使用微量比色皿测定：

1. 组织LPS 活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。LPS (μmol/min/mgprot) =[C标准品×(A测定管-A空白管)÷A标准管]×V反总÷（Cpr×V样）÷T

=10×[(A测定管－A空白管)÷A标准管]÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。LPS (μmol/min/g)=[C标准品×(A测定管-A空白管)÷A标准管]×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T

=10×[(A测定管－A空白管)÷A标准管]÷W

2. 细胞LPS 活性

活性单位定义：37℃中每104个细胞每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (μmol/min/104cell) =[C标准品×(A测定管-A空白管)÷A标准管]×V反总÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T=10×[(A测定管－A空白管)÷A标准管]÷细胞数量

3. 血清等液体LPS 活性

活性单位定义：37℃中每毫升血清每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。

LPS (μmol/min/mL)=[C标准品×(A测定管－A空白管)÷A标准管]×V反总÷V样÷T

=10×[(A测定管－A空白管)÷A标准管]

C 标准品：10µmol/mL；V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：反应中加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W：样本质量，g；T：催化反应时间，10min。

B.使用96孔板测定

1. 组织LPS 活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。LPS (μmol/min/mgprot) =[C标准品×(A测定管-A空白管)÷A标准管]×V反总÷（Cpr×V样）÷T

=10×[(A测定管－A空白管)÷A标准管]÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。LPS (μmol/min/g)=[C标准品×(A测定管-A空白管)÷A标准管]×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T

=10×[(A测定管－A空白管)÷A标准管]÷W

2. 细胞LPS 活性

活性单位定义：37℃中每104个细胞每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。LPS (μmol/min/104cell) =[C标准品×(A测定管-A空白管)÷A标准管]×V反总÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T=10×[(A测定管－A空白管)÷A标准管]÷细胞数量

3. 血清等液体LPS 活性

活性单位定义：37℃中每毫升血清每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。LPS (μmol/min/mL)=[C标准品×(A测定管－A空白管)÷A标准管]×V反总÷V样÷T

=10×[(A测定管－A空白管)÷A标准管]

C 标准品：10µmol/mL；V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：反应中加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W：样本质量，g；T：催化反应时间，10min。注意事项：

1、甲苯有一定毒性，实验过程中需佩戴手套和口罩。

2、实验过程中须远离火源。