实时荧光定量PCR技术

DOI :10. 16437/j . ki . 1007-5038) . 2005-. 12. 025动物医学进展, cn 2005, 26(12:97101专论与讲座

实时荧光定量PCR 技术

蒋春燕, 王泰健, 王　琴＊, 范学政

(中国兽医药品监察所, 北京100081)

中图分类号:Q 503

文献标识码:B

＊

文章编号:1007-5038(2005) 12-0097-05

摘　要:荧光定量PCR 技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR 技术, 是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的, 具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单等优点, 不但能够用于基因定量检测, 还能准确定量疾病相关基因的表达, 现已广泛应用于人类和动物疾病的快速检测、定量分析、早期诊断、基因分型等方面。它可以采用绝对定量和相对定量2种方式实现定量检测, 但都有各自的优缺点, 需根据具体的试验选择合适的定量方式, 从而得到更准确的试验结果。提高荧光定量PC R 技术的特异性和灵敏度需从多方面着手, 主要指特异性探针及引物的设计, 选择合适的M g 2+浓度、引物和探针浓度、循环数等。关键词:荧光定量PC R ; 基因定量; 检测技术

随着基因诊断技术的不断发展和成熟, 基因诊断在临床中的地位显得更为重要。自从1983年Mullis 发明聚合酶链式反应(poly merase chain re -actio n , PCR ) 以来, PCR 技术作为一种重要的基因诊断方法, 以其迅速、简便、灵敏等优点很快成为科研、临床诊断的热点技术。但是传统PCR 技术在应用中遇到了一些难题, 一是不能准确定量, 二是容易交叉污染, 产生假阳性。为克服上述不足, 人们采取了许多方法, 如杂交法、竞争法、酶联法及尿苷酶降解法等, 但均不能得到满意的结果, 直到近年来荧光共振能量转移(fluo rescence resonance energy trans -fer , FRET ) 技术用于PCR 定量后, 上述问题才得到较好的解决。1992年H iguchi 等首次提出了采用动态PCR 方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进

行定量分析, 为解决传统PC R 的难题提出了新的思路。文章旨在介绍目前国内外几种实时荧光定量PCR (real -time fluo rogenetic quantitative PCR , FQ -PCR ) 技术的原理及主要应用现状。

1　实时荧光定量PC R 技术

实时荧光定量PC R 包括探针类和染料类两种, 探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加, 染料类如SYBR Green I 则是利用与双链DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤, 特异性更高; 但后者则简便易行, 成本较低。下面着重介绍荧光探针技术。

荧光探针技术是基于标记基团的FRET 原理而实现的, 当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠, 且两个基团距离足够近时, 能量可以从短波长(高能量) 的荧光基团传递到长波长(低能量) 的荧光基团, 相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽, 这个过程称为FRET 。按其基团标记和能量转移的方式, 目前已经开发出几种相关的技术, 如Taq Man TM 探针、双杂交探针、分子信标、Amplisensor 和LUX TM Primers 等。

1. 1　Taq M an

TM

技术

1. 1. 1　Taq M an TM 技术的工作原理　Taq M an TM 技术是由美国Perkin Elmer (PE ) 公司研制的一种实时PCR 技术, 它在一条20多bp 的寡核苷酸探针的两端分别标记上荧光发射基团(R ) 和淬灭基团(Q ) , 在PCR 反应中设立标准品模板系列和阴性对照, 根据FRET 原理, 探针完整时发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收; 当PC R 扩增时, Taq 酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解, 使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离, 从而荧光监测系统可接收到荧光

＊

收稿日期:2005-08-10

基金项目:国家科技部猪瘟监测技术平台(2004BA519A 19-加强) ; 国家“十五”攻关子课题(2004BA514A16-1) , , , 。＊

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信号, 即每扩增一条DNA 链, 就有一个游离的荧光分子形成, 实现了荧光信号的累积与PC R 产物形成完全同步, 并计算出Rn 值、■Rn 值、Ct 值和阈值。C t 值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR 反应循环数。同时利用标准品模板系列绘制出标准曲线, 结合各样品的Ct 值, 就可以确定样品的起初模板量。常用的荧光基团是FAM , TET , VIC , H EX 。

1. 1. 2　Taq Man TM 技术的应用现状和前景

(1) Taq Man TM 技术在人类传染病诊断和肿瘤研究上的应用。Taq M an TM FQ -PCR 技术具有简便、灵敏、准确等优点, 目前已经在人类传染病诊断和病原定量上得到了应用, 如乙肝病毒[1]、丙肝病毒

[2-3]

目的在于了解制品是否能够达到预期的效果。由于疫苗制品的检定一般多采用生物学方法测定, 因此在检定中就难免会出现检定结果准确性不佳, 究其原因与动物试验过程中的各种因素相关, 这些因素包括:试验动物的个体差异, 如种属、种系、性别、年龄、生理及临床表现; 环境因素、饲养管理条件及营养状况; 所用试剂和原材料的纯度或敏感性不一致、试验程序的差异等。FQ -PC R 技术有望替代动物试验建立测定疫苗效力的方法, 并通过大量的重复性试验和多种技术的符合性试验, 确定FQ -PCR 和动物试验之间以及与疫苗病毒粒子之间的平行关系并最终确定FQ -PCR 法与疫苗效价之间的相互关系, 提高疫苗成品和半成品的检定工作质量。

、艾滋病病毒

[4]

、EB 病毒

[5]

、SA RS 冠状病1. 2　双杂交探针

双杂交探针是Roche 公司新近开发的一种PCR 定量技术, 也是依赖于FRET 原理进行的。该技术的特点是将荧光基团和淬灭基团分别标记在发光探针的5′端和淬灭探针的3′端两个不同的探针上, 两探针可与模板同一条链相邻的序列杂交, 杂交时两探针的荧光基团和淬灭基团便紧密相邻(1个～5个碱基) , 从而发生FRET 而使荧光淬灭, 荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比, 以此可以进行PCR 定量分析。

该方法的特点是淬灭效率高, 但由于两个探针结合于模板上, 因此影响扩增效率; 此外, 由于需要合成两个较长的探针, 合成成本相对较高, 常用的荧光基团是LC -Red640和LC -Red705。双杂交探针技术同样可用于病原体检测[19]、病毒荷载量[20]的测定等领域。

毒[6]和遗传性疾病等的诊断治疗中得到了广泛的应用, 并开发出了转基因动植物基因检测荧光PCR 试剂盒系列和进出口检验检疫荧光PC R 试剂盒系列, 建立的实时荧光定量PCR (FQ -PC R ) 较常规检测方法具有较好的灵敏度和特异性, 通过定量测得其病原体含量与患者的病情变化及严重程度有一定的相关性, 对临床诊断和疗效观察有重要的指导意义。

Taq M an TM FQ -PCR 在人类肿瘤研究上的应用还处在研究和开发阶段, 随着分子生物学的迅猛发展, 肿瘤研究领域的大量研究成果显示, 肿瘤的发生、发展、治疗和预后与肿瘤细胞内部基因和肿瘤相关病毒有关, 在应用于血液系统肿瘤[7], 胃癌[8]患者相关检测中显示, 该方法具较高的敏感性, 对预后和诊断是有力的指标, 最近又有文献报道将FQ -PC R 技术应用到头颈肿瘤

(2) Taq M an

TM

[9]

、口腔肿瘤

[10]

、淋巴瘤

[11]

等

肿瘤中, 得到了较好的检测结果。

技术在动物疾病诊断上的应用。

Taq M an TM FQ -PCR 技术在动物疾病病原体基因的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定上都有较为广泛的应用, 国内外[12-15]都有相关报道。通过RT -PC R 检测口、鼻、泄殖腔等分泌物拭子义; 赖平安等

[17]

[16]

1. 3　分子信标技术

分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针, 环形部分的碱基可与目标核苷酸序列互补, 一般为15个～30个核苷酸长; 茎部是由互相配对的碱基组成, 不能与目标基因相配对结合, 一般5个～7个核苷酸长; 在3′和5′端分别接上发光基团和淬灭基团, 当溶液中有特异模板时分子信标与模板杂交, 从而破坏了发卡结构即实现了FRET , 释放出荧光信号, 荧光的强度与溶液中分子信标的量成正比, 从而实现了对目的基因的定量检测。常用的荧光基团有FAM 和Texas Red 。

目前, 分子信标技术已应用于基因定量分析、疾病基因检测与诊断[21]、单核苷酸多态性(sing le nu -, ) 对早

期诊断、有效预防和控制动物疫情的暴发具重要意

建立了快速通用型“一步法”检测活

禽和禽产品中所有A 型禽流感病毒的FQ -PCR 检测技术, 花群义等[18]采用FQ -PCR 对水疱性口炎病毒(VSV ) 的鉴定检测, 都为畜禽疫病的检疫、动物性食品安全检验提供了一种新方法。

(3) Taq Man

TM

技术在疫苗效力测定上的应用

,

蒋春燕等:实时荧光定量P CR 技术

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和临床研究, 如姜晓峰等织DNA p16基因检测。

[22]

将毛细管电泳技术和分高, 采用灵敏的荧光检测系统对荧光信号进行实时监控; ③线性关系好, 由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系, 通过荧光信号的检测对样品初始模板浓度进行定量, 误差小; ④操作简单, 自动化程度高, FQ -PCR 技术对PC R 产物的扩增和检测在闭管的情况下一步完成, 不需要开盖, 交叉污染和污染环境机会少; ⑤没有后处理, 不用杂交、电泳、拍照。

子信标技术结合, 用于胃癌患者的癌组织及癌旁组

1. 4　Amplisenso r

这是美国Biotrnics Tech 公司推出的荧光定量PCR 检测系统, 其基本原理也是FRE T 。先进行一次不对称扩增; 第2轮扩增时, 在双链信号引物的两条互补链上, 分别标记荧光供体和受体, 当信号引物处于双链结构时产生荧光。在PCR 过程中, 变性使引物荧光基团分离, 复性时引物将优先与不对称扩增产物结合, 使引物不再产生荧光。Am -plisenso r 检测系统采用半套式扩增和双链引物, 特异性高, 灵敏度与竞争性PCR 相似, 检测范围可达10～10。现已应用于乙型肝炎病毒DNA

3

11

[23]

2. 2　FQ -PCR 技术与传统定量方式的区别

传统的定量PCR 主要是指倍比稀释法、内参照法、竞争法和PCR -ELISA 法等, 这些定量PCR 技术的不足之处主要在于:难以确定PC R 正处于线性扩增范围内(只有在此范围内PC R 产物信号才与初始模板的拷贝数成比例) ; 线性扩增范围确定以后, 如何找到一个合适的方法检测结果; 大多数是终点检测, 即PCR 到达平台期后进行检测, 重现性差。

而FQ -PCR 技术是采用始点定量的方式, 同时运用高灵敏度的荧光检测系统实时监控每个循环的累积荧光强度, 并通过确立Ct 值的方法确立样品起始模板数从而实现定量, 由线性方程C T =-klgX +b (X 指原始模板数) 表明, 每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系, 起始拷贝数越多, C t 值越小。PE 公司曾在同一台PCR 仪上对相同模板进行96次扩增, 96条扩增曲线显示随着循环次数的增加重复性变差, 而在CT 值处PC R 产物数量的重现性极好, 所以在Ct 值处对起始核酸进行定量更具意义, 此时误差没被放大, 并且此时扩增效率也恒定, 处于线性扩增范围内。

、结

核性脑膜炎[24]、外周血中结核分支杆菌DNA [25]、肺外结核[26]的定量分析, 对诊断和判断病毒是否复制、复制程度及病情变化提供可靠依据。

1. 5　LUX 引物

LUX (light upon ex tention , LUX ) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术

[27]

, 使引物

同时起到荧光探针的作用。使用LUX 引物, 不需要专门设计探针, 即节省了成本, 又给实验设计提供了宽松的条件。由于没有探针控制特异性, 因此它的特异性要弱于探针技术, 但不受非特异性扩增或引物二聚体影响, 所以其特异性要强于SYBR Green I 。SYBR Green I 是一种能与双链DNA 小沟结合发光的荧光染料, 没有特异性, 不能识别特定的双链, 对PCR 反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光。

以上FQ -PCR 探针技术都是根据FRET 的原理, 因此发生能量转移的两个基团之间的距离要求相当严格。从国内外的实验检测结果来看, 上述的各种技术均能够较好的解决这一问题, 从探针设计要求和目前国内外的科研及临床应用情况来看, Taq M an

TM

2. 3　FQ -PCR 技术的两种定量形式

2. 3. 1　绝对定量　FQ -PC R 一般采用外标准品定量的制备来实现绝对定量, 可以通过化学合成目的基因; 或是将PCR 扩增产物直接梯度稀释; 或是将PCR 产物克隆到载体上, 然后抽提出质粒, 经过测量浓度和拷贝数可准确定量, 它的优点是稳定、准确。对于RNA 样品, 标准品最好是体外转录的RNA , 如果用cDNA 、PCR 产物作为标准品, 虽然制备简单易于保存, 但是将会因为标准品无法准确指示样品反转录效率, 而给最终定量起始拷贝数带来影响。

绝对定量也具有相应的缺陷, 标准品的稳定保存很难获得成功; 目前广泛使用的在260nm 波长下定量的方法与众多因素有关, 如水、缓冲液、仪器性, 技术的探针设计较为简单, 为广大应用

者所选择。

2　FQ -PCR 技术的优点及与传统定量方式的区别

2. 1　FQ -PCR 技术的优点

FQ -PCR 的优点可以归纳为:①特异性好, FQ -PCR 技术通过引物或和探针的特异性杂交对模板,

100性。

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的浓度无法使Taq 酶发挥最佳活性, 无疑将会影响到实时定量的敏感性; 其次, Mg 2+的浓度过高, 会增加引物二聚体的形成, 从而导致敏感性降低。一般来说, 对以DNA 或cDNA 为模板的PCR 反应, 应选择2mmol /L ～5mmol /L 浓度的MgCl 2, 对以mRNA 为模板的RT -PCR 而言, 则应选择的浓度为4mmol /L ～8mmol /L 。引物和探针的浓度也会影响反应的特异性, 较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。最佳的引物浓度一般在0. 1μmol /L ～0. 6μmol /L , 探针的浓度在0. 05μmol /L ～0. 3μmol /L 之间, 可以在这个基础上再进一步优化, 以达到引物探针整体的最佳浓度。

2. 3. 2　相对定量　相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因, 该管家基因主要是用于核苷酸的拷贝数的比较、反映反应体系内是否存在PCR 扩增的影响因素, 通常选用的管家基因有GA PDH 、β-actin 、β2-微球蛋白和rRNA 。使用的相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线, 根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量, 再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。这一方法的缺陷是要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致; 此外加入已知起始拷贝数的内标相当于是进行双重PC R 反应, 存在两种模板相互的干扰和竞争。

在实验生物学及临床医学的一些场合, 由单纯PCR 所提供的阳性或阴性结果还远远不够, 在阐述许多问题的本质时, 基因及其表达的定量起着至关重要的作用。绝对定量和相对定量都有各自的优缺点, 所以需根据具体的实验需要选择采用合适的定量方式, 从而得到更准确的实验结果。

3. 3　循环数

PCR 扩增效率理论上为100%,PCR 产物随循环的进行成指数增长, 通常扩增效率≤1, 并在整个PCR 扩增过程中不是固定不变的, 循环次数n ≤30时, 扩增效率相对稳定, 原始模板以相对固定的指数形式增加, 适合定量分析, 这也就是通常所说的指数期, 在实验中一般将C T 值大于30的样品重新检测以排除假阳性的可能。但是对于那些极微量的待测样本而言, 适当增加循环数可以提高反应的检出底限, 循环数建议为40, 但是并非循环数增加的越多, 其敏感性就会越高, 实际上, 当循环数增加到某一值时, 敏感性便不再升高。

3　提高FQ -PC R 技术检测方法的特异性和灵敏度

3. 1　探针及引物的设计要求

理论上, 只要设计的引物对目的基因有足够的特异性就能保证荧光定量PCR 检测方法的特异性和灵敏度, 但实验过程中影响FQ -PC R 特异性敏感性的因素众多, 除了一般PC R 反应均存在的影响因素如反应体系、Taq 酶的活性、引物二聚体之外, FQ -PCR 还有其特殊的影响因素, 如反应体系中形成的引物-探针二聚体产生的影响, 可以使用热启动办法消除也可以尽可能地优化引物探针的设计, 如设计时两条引物不能互补(尤其在3′端) 、使两条引物的GC 含量大致一致、将探针3′末端完全磷酸化使之不能延伸、使用纯化的引物探针进行实验等。在Taq M an TM 探针设计时还应避免重复出现相同的核苷酸, 特别是连续出现≥4个G 的情况; 探针的5' 端的第1个碱基避免是G ; 探针序列中碱基C 的含量应高于G 的含量; 引物与探针要尽量靠近但不能重叠, 上游引物的3′和探针的5′之间的距离在1bp ～15bp 之内。

4　结语

FQ -PCR 技术克服了传统检测技术由于样品病原体含量较低带来的检测难度, 通过设计针对目的基因的特异性引物和探针, 并优化反应体系和反应循环参数可成功地建立快速、灵敏、特异的FQ -PC R 检测方法, 可实现大样本同时检测, 并节省大量试验时间和反应成本, 为基因定量检测和准确定量疾病相关基因的表达提供了有效的技术手段, 同时实现对人类和动物疾病的早期诊断与基因分期、分型, 以及对人类肿瘤转移的早期发现及预后判断, 因此FQ -PCR 技术在临床上将有更加广阔的应用前景。

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2+

2+

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