SephadexG-25凝胶过滤层析脱盐技术

Sephadex G-25 凝胶过滤层析脱盐技术

实验目的

1、了解凝胶过滤层析技术的原理

2、熟悉凝胶过滤层析的装柱技术及操 作过程

3、熟悉Sephadex G-25凝胶过滤层析脱盐技术

液相流路：缓冲液存储器→恒流泵→上样阀→Sephadex G-25 层析柱→紫外检测仪→记录仪

部分收集器

实验原理

凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

凝胶过滤层析脱盐。高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％。

凝胶过滤层析其它应用。1、用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。2、测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的的分子量。3、高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。

实验试剂

1. 0.01mol/L,pH8.6 Tris-HCl缓冲液

2. 蛋白质样品溶液（含Nacl)

实验材料及仪器

微孔滤膜（0.22μ m)、 一次性滤器 、 注射进样器、AKTAprime蛋白质纯化系统、HiTrap Desalting prepacked column (26mL)（Pharmacia, GE Healthcare)

AKTAprime蛋白质纯化系统

为实验室规模的蛋白质纯化而设计。和传统的手动操作比较，AKTAprime提供高速，高载量和组份收集的优点. 各式预装柱加上内置的应用模板，AKTAprim只需您按一个键就可以进行

纯化。