猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

唐先春1, 吴 斌1*, 索绪峰2, 王大林2 , 陈焕春1, 尹争艳1

（1. 华中农业大学动物病原微生物实验室, 武汉 430070）

（2. 海口市美兰区罗牛山兽医站, 海南 571133）

摘 要: 用PCR 方法配合生化鉴定，从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis, PAR) 症状猪的鼻拭子中分离出66株多杀性巴氏杆菌(Pasteurela multocida , Pm) 。然后做了药敏试验，并用PCR 方法对这66株Pm 进行分型及毒素基因的检测, 用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌（Toxigenic Pasteurella multocida, T+Pm ）进一步鉴定。结果显示PCR 鉴定与生化鉴定Pm 结果完全一致；PCR 分型表明有46株为D 型Pm ，18株为A 型Pm ，1株为B 型Pm ，1株无法定型；有8株用PCR 检测为T +Pm ；豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T +Pm 的进一步鉴定，也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8株T +Pm 都为D 型，都分离于有严重PAR 症状的猪。

关键词: 多杀性巴氏杆菌； 产毒多杀性巴氏杆菌；PCR ；分型；药敏试验

中图分类号: S852.61+2 文献标识码: A 文章编号: 0366-6964(2005)0

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida, Pm）是一种重要的病原，可以导致猪肺疫、牛羊出败、禽霍乱等危害严重的畜禽传染病。产毒多杀性巴氏杆菌（Toxigenic Pasteurella multocida , T+Pm ）是猪进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis, PAR)的主要病原菌。该病是养猪业的一种重要传染病，其主要表现为：慢性鼻炎、颜面部变形、鼻甲骨萎缩或由于经常打喷嚏而造成鼻出血。哺乳仔猪感染本病后，除引起鼻甲骨甚至鼻腔变形、萎缩或消失外，还可以引起全身钙代谢障碍，致使仔猪发育迟缓、饲料利用率降低，有时伴发急、慢性支气管炎，导致仔猪死亡。育肥猪感染本病后，呼吸道的正常结构和功能遭到损害，致使机体抵抗力降低，极易感染其它病原，诸如支原体、胸膜肺炎放线杆菌、副嗜血杆菌、猪流

～感病毒、猪生殖—呼吸道综合征病毒等，引起猪呼吸道综合征，增加猪的死亡率 [14]。

多杀性巴氏杆菌按荚膜的不同可分为A 、B 、D 、E 、F 5个血清型。研究表明，T +Pm 主要是D 型Pm ，而且T +Pm 主要分离于具有严重PAR 症状的猪，从有肺炎症状猪分离的Pm 一般是不产毒素的[5, 6]。

T +Pm 与T -Pm 在形态特征及生化反应特性上没有区别。与PAR 密切相关的T +Pm 产生一种约145kDa 的皮肤坏死毒素（Dermonecrotic toxin, DNT），该毒素由toxA 基因编码。一

～般认为T -Pm 不会导致PAR ，而提纯的DNT 可以导致PAR 的发生[79]。所以，DNT 是诊断

及控制PAR 的关键，也是区分T +Pm 与T -Pm 的关键。

基于DNT 的特性，已经建立了一些检测方法，以区分T +Pm 与T -Pm ，如豚鼠皮肤坏死试验、小鼠致死试验[10]、细胞促生长试验、胎牛肺细胞毒性试验[11]、ELISA [5]。但这些毒素检测方法，无论是动物试验还是细胞培养，操作繁琐，费时费力，在临床上的应用都有很大的局限性[5]。随着T +Pm 毒素基因的分子生物学研究，以及近年来PCR 检测方法的广泛应用，使T +Pm 的检测越来越简便、灵敏和完善。

1 材料与方法

1.1酶及主要试剂

收稿日期：2004-04-05

基金项目：国家自然科学基金项目资助（30471292）

作者简介：唐先春（1978-），男，汉，湖北十堰人，硕士，主要从事产毒素多杀性巴氏杆菌方面研究， E-mail:[email protected]。 *通讯作者 Tel:027-87288629

Taq DNA 聚合酶购自TaKaRa ；生化鉴定管及药敏试纸购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 病原菌的分离

病料来源于海南、湖北、湖南、广东、广西、上海等十多个省市。对于有明显鼻萎缩症状的猪，鼻盘消毒后采其鼻拭子；部分病料是送检的无鼻萎缩症状的猪以及病肺，无菌采其肺组织。将采集的病料划线接种于胰蛋白大豆琼脂（Tryptic Soy Agar，TSA ）平皿，37℃培养18～24h 后观察，挑取直径1～2mm 、透明、光滑、湿润的菌落进行革兰氏及瑞氏染色。革兰氏染色呈红色的细小球杆菌，瑞氏染色呈两极浓染的细菌为可疑菌落，对其传代纯化，进一步做生化及PCR 鉴定。

1.3 生化鉴定

对于纯化好的可疑菌落按使用说明做以下生化实验：葡萄糖、果糖、甘露醇、麦芽糖、乳糖、鼠李糖、吲哚、MR 、VP 、硝酸盐还原，并接种于麦康凯培养基。

1.4 药敏试验

已纯化好的Pm ，挑取单菌落接种与脑心浸液（Brain and Heart Infusion, BHI）培养基，培养14h 。比浊法记数后，用BHI 稀释菌液至终浓度为3.0亿/mL。用灭菌棉拭子在TSA 平皿上均匀涂布，待菌液吸收后，贴药敏纸片，37℃培养16～20h, 记录结果。

1.5 PCR鉴定

1.5.1 本试验所用PCR 引物见表1：

表1 本试验所用PCR 引物

Table1 PCR primers used in this experiment

引物用途

鉴定Pm

鉴定A 型Pm

鉴定B 型Pm

鉴定D 型Pm

鉴定E 型Pm

鉴定F 型Pm

鉴定T +Pm 引物编号 KMT1 KMT2 PmA1 PmA2 PmB1 PmB2 PmD1 PmD2 PmE1 PmE2 PmF1 PmF2 TA1

TA2 引物序列（5' —3' ） ATC CGC TAT TTA CCC AGT GG GCT GTA AAC GAA CTC GCC AC GAT GCC AAA ATC GCA GTC AG TGT TGC CAT CAT TGT CAG TG CAT TTA TCC AAG CTC CAC C GCC CGA GAG TTT CAA TCC TTA CAA AAG AAA GAC TAG GAG CCC CAT CTA CCC ACT CAA CCA TAT CAG TCC GCA GAA AAT TAT TGA CTC GCT TGC TGC TTG ATT TTG TC TCG GAG AAC GCA GAA ATC AG TTC CGC CGT CAA TTA CTC TG CTT AGA TGA GCG ACA AGG GAA TGC CAC ACC TCT ATA G PCR 产物/bp 457 1048 758 647 512 852 864

注：以上引物参照文献[12～15]及NCBI 上发布的序列设计，由上海生工合成。

Note: All these primers were designed referred to the references of 12～15 and gene sequences published on NCBI. All primers were synthesized by Shanghai Sangon.

1.5.2 PCR模板 用接种环挑取单菌落，悬浮于含50µL 无菌水的离心管中，100℃水浴中煮5～10min ，然后迅速置于冰上冷却5min ，10 000r/min离心2min ，上清即为PCR 模板。

1.5.3 PCR反应体系（25µL ） 10×Taq Buffer2.5µL ，25mmol/1MgCl2 0.5µL ，2µmol/LdNTPs 0.5µL ，20µmol/L上、下游引物各0.5µL ，Taq DNA 聚合酶0.5µL ，无菌水10µL ，模板10µL 。

1.5.4 PCR反应条件 94℃变性4min ，然后进入30个循环：94℃30s 、56℃30s 、72℃40s ，最后72℃延伸10min ，PCR 产物8℃短时保存。

1.5.5 PCR 结果观察 取PCR 扩增反应产物10µL 和5µL 分子量标准，加到含EB 的0.8%琼脂糖胶中，在80V 电压下电泳30min ，然后在紫外线灯下观察。

1.6 DNT的动物试验检测

1.6.1 豚鼠皮肤坏死试验 待检菌株接种于BHI 培养18h ，然后12 000r/min离心10min ，上清用0.2µm 的滤膜过滤。滤液0.2mL 注射于体重350～400g 健康豚鼠的剃毛背部，观察72h 。注射部位皮肤坏死区直径≥5mm 为DNT 阳性；＜5mm 疑似，需复试；无反应或仅轻微红肿者为阴性[6, 10]。

1.6.2 小鼠致死试验 待检菌株接种于TSA 培养24h ，用灭菌PBS 洗脱菌苔并稀释至1010cfu/mL，菌液置于冰浴中超声破碎3次，每次10s 。裂解物12 000r/min离心30min ，上清依次用0.45µm 和0.22µm 过滤，0.5mL 滤液腹腔接种于20g 左右的BALB/C小鼠。每株菌接种4只小鼠，72h 内全部死亡者为DNT 阳性，部分死亡者需复试[10]。

2 结 果

2.1 多杀性巴氏杆菌生化鉴定

凡是麦康凯上不能生长，发酵葡萄糖、果糖、甘露醇产酸不产气，不发酵麦芽糖、乳糖、鼠李糖，吲哚、硝酸盐还原试验阳性，MR 、VP 试验阴性者判为多杀性巴氏杆菌。结果共分离出66株多杀性巴氏杆菌，其中24株分离于肺脏，42株分离于鼻拭子。

2.2 12种抗菌素对66株多杀性巴氏杆菌的抗药谱

表2 12种抗菌素对66株多杀性巴氏杆菌的抗药谱

Table 2 Medicine sensitivity of 66 isolates to 12 antibiotics

抗 生 素 判 定 标 准 / mm

耐 药

φ

φ

φ

φ

φ

φ

φ

φ

φ

φ

φ

φ16 >16 >14 >17 >16 >16 >12 >14 >16 >16 >14 >17 高 敏 9(13.7%) 52(78.8%) 32(48.5%) 59(89.4%) 30(45.5%) 41(62.1%) 20(30.3%) 35(53.0%) 21(31.8%) 46(69.7%) 27(40.9%) 19(28.8%) 试 验 结 果 中 敏 29(43.9%) 9(13.6%) 12(18.2%) 4(6.1%) 13(19.7%) 13(19.7%) 14(21.2%) 12(18.2%) 27(40.9%) 12(18.2%) 24(36.4%) 32(48.5%) 耐 药 28(42.4%) 5(7.6%) 22(33.3%) 3(4.5%) 23(34.8%) 12(18.2%) 32(48.5%) 19(28.8%) 18(27.3%) 8(12.1%) 15(22.7%) 15(22.7%) 1 强力霉素 2 先锋霉素 3 四 环 素 4 氯 霉 素 5 氨苄青霉素 6 氟 哌 酸 7 青 霉 素 8 庆大霉素 9 痢 特 灵 10环丙沙星 11卡那霉素 12红 霉 素

2.3 多杀性巴氏杆菌的PCR 鉴定

在Pm 分离过程中用检测Pm 的引物KMT1-KMT2配合生化鉴定，结果表明凡是KMT1-KMT2扩增为阳性的菌株生化结果都符合Pm 标准，而阴性者都不完全符合。而且我们对分出的第一株阳性PCR 产物回收测序，与NCBI 上发布的7个Kmt 基因序列对比，同源性都在97.6%～99.8%（测序结果略）。

2.4 多杀性巴氏杆菌的PCR 分型

对分离的66株Pm 分别用各型的引物扩增，结果有46株为D 型，18株为A 型，1株为B 型，1株无法定型，没有E 、F 型。其中46株D 型有28株分离于鼻拭子，18株分离于肺脏。18株A 型有14株分离于鼻拭子，4株分离于肺脏。B 型1株分离于肺脏。1株未定型者分离于肺脏。

2.5 产毒多杀性巴氏杆菌的PCR 鉴定

对分离的66株Pm 用检测tox A 基因的引物TA1-TA2扩增，结果有8株扩增为阳性，这8株都分离于有PAR 症状猪的鼻拭子。对其中一阳性PCR 产物回收测序，与NCBI 上发布的4个tox A 基因全序列对比，与其中3个序列同源性100%，与另一序列同源性99.7%(658/660)，可见该引物所扩增序列相当保守（测序结果略）。

图1 PCR 检测Pm 、T +Pm 及对A 、B 、D 型Pm 分型电泳图谱

Fig 1 The result of testing Pm, T+Pm and typing Pm of serogroup A,

B, D by PCR showing on the agarose gel electrophoresis

1:多杀性巴氏杆菌(KMT1-2为引物) ；2: A 型多杀性巴氏杆菌

(PmA1-2为引物) ；3: B型多杀性巴氏杆菌(PmB1-2为引物) ；4: D

型多杀性巴氏杆菌(PmD1-2为引物) ；5: 产毒素多杀性巴氏杆菌

(TA1-2为引物) ；M: DL2000

1: Pm (KMT1-2 was primers); 2: Pm of serogrope A (PmA1-2);

3: Pm of serogrope B (PmB1-2); 4: Pm of serogrope D

(PmD1-2); 5: T +Pm (TA1-2); M: DL2 000

2.6 多杀性巴氏杆菌毒素的检测

对8株PCR 检测为阳性的T +Pm 做了豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验。豚鼠皮肤坏死试验8株全为阳性，大多数菌株坏死区直径为7～12mm ，其中两株坏死区直径达到16mm ，坏死区呈红紫色至黑色。小鼠致死试验有6组（6株菌）小鼠72h 内全部死亡，2组在初试时4只小鼠各有1只没死，但复试时4只全死。小鼠死亡时间大多在20～48h 内。

3 讨 论

在Pm 分离过程中我们采用了PCR 方法，由于引物KMT1-KMT2具有很强的灵敏度及特异性，大大降低了分菌工作的难度。敏感性试验表明该引物可以检测低到103个cfu 的模板量，而且用呼吸系统常见菌如：胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌、链球菌及大肠杆菌做模板都不能扩出特异带型。一般在第一代平皿上挑菌做PCR ，若为阳性，都能分出Pm ，若为阴性很难分出Pm 。而且PCR 结果与生化结果完全吻合，即凡是KMT1-KMT2扩增为阳性的菌株生化结果都符合Pm 标准，而阴性者都不完全符合，可见该引物具有很强的特异性。

药敏试验结果表明，所分离的66株Pm 对氯霉素、先锋霉素、环丙沙星表现较高的敏感性。但氯霉素已禁用，临床上可首选其他两种药物。

各方面报道表明T +Pm 主要是D 型Pm ，极少数A 型Pm 也产毒素，而且T +Pm 主要分离于具有严重PAR 的猪，从肺炎症状猪的肺脏分离的Pm 一般是不产毒素的，而且多为A 型[5, 6, 15]。我们对分离的66株Pm 进行PCR 分型，结果有69.7%(46/66)为D 型，27.3%(18/66)为A 型，仅1.5%(1/66)为B 型，没有分出E 和F 型。单从来源于肺脏的Pm 来看，16.7%（4/24）为A 型，75%（18/24）为D 型，4.2%（1/24）为B 型。然而，C Pijoan 报道从肺脏分离的Pm 有87.5%为A 型，12.5%为D 型[6]。L Robert报道从肺炎症状猪分离的Pm75%为A 型，13%为D 型；从有PAR 症状猪分离的Pm 有29.4%为A 型，70.6%为D 型[15]。我们所用的分型方法与L Robert的方法相同，但结果差异较大，这可能是因为我国血清型流行与国外不同；也可能是因为我国血清流行的区域性，这还需进一步广泛分菌调查。不过单从有PAR 症状的猪来看，有66.7%(28/42)为D 型，这与L Robert 报道的70.6%为D 型接近。在

PCR

定型过程中，有1株Pm 用引物KMT1-KMT2扩增为阳性，生化结果也完全符合Pm 标准，但用5对分型引物都没有扩出特异性的带，无法定型，这可能是因为该菌株变异较大。L Robert 所分离的158株Pm 也有2株无法用该PCR 方法定型。

据报道，目前国内畜禽流行的多杀性巴氏杆菌荚膜血清型主要是A 、B 和D 型，没有E 型。猪肺疫由A 、B 型Pm 引起，D 型菌株引起AR ，禽霍乱由A 型Pm 引起[16, 17]。苑士祥等自患AR 猪分离93株Pm 经间接血凝试验鉴定86株为D 型（92.5%），6株为A 型（6.5%），1株未定型（1%）[18]。彭发泉等报道1985-1988共分离74株Pm ，有7株A 型，67株D 型。均为不产毒素菌株[19]。杨留战等报道从临床有萎缩性鼻炎的猪场分离到A 型Pm 20株（5株T +Pm ），D 型85株（76株T +Pm ）。产毒素菌株占总分离株的77.1%（81/105）。从临床无萎缩性鼻炎的猪场分离到A 型Pm1株，D 型5株（1株T +Pm ）[20]。本研究与国内有关报道基本一致。

我们所分离的66株Pm 只有8株为产毒素菌株，所占比例仅为12.1%(8/66)，而且这8株T +Pm 均分离于有PAR 症状猪的鼻拭子，均为D 型。这与国外报道的T +Pm 分离比例有所差异，C Pijoan报道仅从肺脏分离的Pm 就有22.8%产毒素（12.8%为A 型，10%为D 型）

[6]，L Robert报道从肺炎症状猪分离的Pm 仅有1.8%产毒素（0.9%为A 型，0.9%为D 型），从有PAR 症状猪分离的Pm 也有52.9%为T +Pm （11.7%为A 型，41.2%为D 型）[13]。而我们从肺脏分离的24株Pm 均不产毒素，从有PAR 症状的猪所分离的T +Pm 也只占19%(8/42)。看来在我国，PAR 的发生更主要的也许还是环境方面因素影响。不过，杨留战等报道所分离的111株Pm 有82株T +Pm （占73.9%）。他们用的是豚鼠皮肤坏死试验检测毒素，我们用的是PCR 方法，综合国内外研究表明，动物试验检测毒素所得T +Pm 比例都偏高，可见 PCR 方法特异性更强，相信也更可靠。

豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验检测DNT 结果与PCR 检测tox A 基因结果一致，即PCR 检测为阳性的菌株，豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验也为阳性。虽然有2株T +Pm 在第一次小鼠致死试验时4只小鼠各有1只没死，但在复试时攻毒小鼠全被致死。这可能与小鼠个体差异有关，也可能是这2株菌本身产毒素能力较弱。我想，PCR 从基因水平检测T +Pm 比动物试验更简便、灵敏，也更有说服力。而且对PCR 产物测序结果表明引物TA1-TA2所扩增序列相当保守，这进一步确立了该PCR 检测方法的可靠性。

4 结 论

PAR 是规模化猪场的一种重要传染病，严重影响猪群健康状况及饲料利用率。当前对该病的控制主要还是靠免疫接种和药物治疗。然而，虽然几乎所有猪场都在用萎鼻疫苗及抗生素防治，但各猪场仍时有PAR 的发生，药物治疗效果也不明显。对T +Pm 的分离鉴定，为该病的快速诊断试剂及高效疫苗的研制、开发奠定了基础。同时，对各血清型的多杀性巴氏杆菌在我国猪场流行情况以及对药物敏感情况做了初步探讨，有利于对猪巴氏杆菌病的防治。

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The Isolation, Identification and Biological Characteristics

Research of Swine Pasteurella multocida

TANG Xian-chun1, WU Bin1, SUO Xu-feng2, WANG Da-lin2, CHEN Huan-chun1, YIN Zheng-yan1

(1. Animal Pathogenic Microorganism Lab, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)

(2. Luoniushan Veterinary Station, Meilan District, Haikou 571133)

Abstract: With PCR and biochemical reaction test, sixty-six strains of Pasteurella multocida (Pm) was isolated from the lung tissues of pneumonic swine or nasal swabs of swine suffering progressive atrophic rhinitis(PAR) swine. Their medicine sensitivity was then studied. PCR assay was used to type these Pm isolates, as well as test the toxA gene. Guinea pig skin test and mouse lethal test were used to study the toxigenic pasteurella muttocida (T+Pm). The results showed that all PCR positive strains were coincident with the biochemical reaction criteria of Pm. PCR typing assay indicated that forty-six strains were serogroup D, eighteen strains were serogroup A, one strain was serogroup B and one strain was untypable. And eight strains were identified as T+Pm by PCR method. Guinea pig skin test and mouse lethal test also confirm the eight isolates were T+Pm. All the eight T+Pm strains were serogroup D, and were isolated from the swine suffering severe PAR.

Key words: Pm, T+Pm, PCR, typing, medicine sensitivity