硅胶吸附柱色谱技术实际应用

硅胶吸附柱色谱技术实际应用0 管理提醒： 本帖被 迷路的小孩 执行加亮操作(2007-07-18)色谱法，又称层析法. 是一种以分配平衡为机理的分配方法. 色谱体系包含两个相, 一个是固定相, 一个是流动相. 当两相相对运动时, 反复多次的利用混合物中所含各组分分配平衡性质的差异, 最后达到彼此分离的目的.

色谱法从发明到现在已有八十多年的历史. 它是纯化和分离有机或无机物的一种方法.

色谱法按固定相的状态可分为柱色谱. 平板色谱和棒色谱三种而实验室中最常用的是柱层析和薄层层析, 以及它们之间的配合应用.[1]

柱层析[2]

1 吸附色谱地原理

在一定条件下, 硅胶与被分离物质之间产生作用, 这种作用主要是物理和化学作用两种. 物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间的范德华力. 化学作用主要是硅胶表面的硅羟基与待分离物质之间的氢键作用.

2操作步骤

2.1 硅胶准备[3]

硅胶一般选用250-400目(即40-63μm 直径的硅胶颗粒), 根据ΔRf 选用硅胶的用量.

2.2 实验仪器准备

一支玻璃色谱柱, 一个铁架台, 烧杯, 锥形瓶, 径口直径较大的玻璃漏斗, 一支玻璃棒,

2.3 装柱[4]

2.3.1 吸附剂的加入

①干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞，加入适量的流动相，旋开活塞使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。

②湿法：将吸附剂与流动相混合，搅拌以除去空气泡，徐徐倾入色谱管中，然后再加入流动相，将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱表面平整。 俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下，液面将柱表面相平时，即加试样溶液.

2.3.2试样的加入

①将试样溶于层析时使用的流动相中，再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿使吸附剂翻起。或将试样溶于适当的溶剂中。与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状；将混有试样的吸附剂加在已制备好的色谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解，可将试样与适量的吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。

2.4洗脱 [5]

除另有规定外，通常按流动相洗脱能力大小，递增变换流动相的品种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸附层的上面。

2.5 检测

2.5.1 初步检测

当冲洗溶剂流出一定量后, 可对流出液进行初步检测, 并且将锥形瓶更换成小试管进行收集. 一般只进行初步的快捷检测, 因此通常是取一小薄层板, 用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块, 并安一定的次序编号. 取一根内径为0.3mm 左右的玻璃毛细管蘸取少量流出液, 点于薄层板的一个小格内, 待半点干后, 然后用物理的或化学的方法检测.

2.5.2 正式检测

① 点样: 取分部收集的冲洗溶液进行分别直接点样, 如果冲洗溶液太稀, 浓度太小, 可先浓缩. 点样的容器一般用玻璃毛细管, 点样斑点的直径一般为3-5mm.

② 展开:在普通的展开槽中进行, 展开方式常选用上行展开.

③ 展开剂:实用冲洗溶液.

④ 显色:一般常用物理检测法和化学检测法. 物理检测法中首先有紫外光法, 紫外光常用两种波长(254nm与365nm). 其次是碘蒸气显色法. 化学检出法通常惊醒显色剂直接喷雾. 显色剂有通用显色剂和专用显色剂. 通用显色剂最常见的是硫酸-乙醇或甲醇(1:1)溶液, 喷雾后, 有的化合物立即反应, 但多数化合物需加热后经历数分钟才显色, 不同化合物的反应不同, 所以颜色也往往不同. 专用显色剂是指对某个或某一类化合物显色的试剂, 利用化合物本身的特有性质, 或利用其所含的某些官能团的特殊反应. 展开后根据斑点的, 可以粗略的估计待分离物的含量的大小.

2.6 合并

根据上面薄层检测的结果, 我们可以将具有相同Rf 指的部分进行合并, 然后利用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸发, 最后得到我们需要的目标产物.

2.7色谱柱的洗涤

在绝大多数情况下, 硅胶分离柱中的硅胶是一次性使用, 但在使用后的色谱柱中由于还含有冲洗溶剂, 所以要将里面的硅胶到出是比较困难的. 取出硅胶的一种方法是将该柱防治一段时间, 让溶剂自然会发完后, 倒出硅胶. 但这种方法既费时又污染环境. 第二种方法可以用一根比色谱柱稍长的木杆或塑料杆将含有溶剂的硅胶一段一段地掏出, 但这种办法也比较麻烦. 第三种方法时利用一个一般地真空泵, 经的普柱中剩余地溶剂进行减压抽出, 在色谱柱和真空泵之间加一个冷阱, 这样抽出地溶剂既进行了有效地收集而不污染环境, 而色谱柱中地硅胶又能较快得到干燥, 使硅胶能够方便地倒出.

3 色谱柱的选择

柱子可以分为：加压[6]，常压[7]，减压[8]。

压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。

①减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。

②加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。

③常压柱色谱，又称柱层析，是色谱法中最常见的一种。它的突出优点是，分离效率比经典的化学分离方法高的多，与其他色谱法相比，不需要昂贵的仪器设备，更换流动相和吸附剂方便，消耗材料少，成本低，适合分离取样量从克到微克级范围很宽的各种样品，因此在化学实验室中至今仍被广泛应用。

4 溶剂的选择 [1]

溶剂的选择也许是整个柱色谱分离操作中最困难之处, 也是实验成功的最关键之处. 溶剂通常先利用简便的硅胶薄层色谱进行筛选.

4.1 薄层色谱点样[9]

把样品溶解在一种低沸点的有机溶剂中(如氯仿, 丙酮. 甲醇. 乙醇等) 然后用毛细管或微量点

样管将试液点到薄层板上. 点样量要适当, 一般点样量少些, 则分离叫清晰. 但要注意到检测灵敏度.

4.2 展开[10]

4.2.1展开剂选择[11]

选择展开剂时, 可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择.

①微量圆环法:将欲分离的物质, 按常规方法点在薄板, 两点相距2-3cm, 再用毛细管吸取所实验的溶剂系统, 垂直放于样点中心, 让溶剂自毛细管中依中立流出进行展开, 干燥后显色. 观察斑点的分离情况. 背试物质为未知化和物时, 常先用低极性溶剂展开, 如式样留在圆点不动, 则需增加溶剂的极性或增大洗脱液的量, 如移动过快, 则必须用较低极性的溶剂来调整.

②小型色谱法. 用普通的载薄片制成薄板, 把欲分离的物质点载薄板上, 放于小型玻璃缸或广口瓶中展开, 干燥后显色, 观察斑点分离情况.

4.2.2 展开

薄层色谱的展开方法有上行法, 下行法, 双向展开法, 径向展开法等

① 上行法:使展开剂由下向上爬.

② 下行法:使展开剂由上向下. 该法可使用极性较弱的展开剂.

③ 双向展开法:取方形薄板像纸色谱一样进行双向展开.

④ 径向展开法:可将吸附剂涂成圆形或扇形, 在圆心部分加如展开剂, 使薄层径向展开. ⑤ 多次展开:用展开剂对薄层展开一次. 称为单次展开. 一次展开后, 取出薄板, 挥发出去展开剂后再行展开.

⑥ 梯度展开:该法所用的展开剂在连续不断的改变组成. 一般可把一个装有强极性展开剂的滴定管深入密闭的含弱极性的展开剂的层析槽中, 槽中用电磁搅拌器把滴下的强极性展开剂混匀, 此时, 展开剂的极性逐渐由弱变强, 使极性差别较大的多种组分混合物得以很好的分离.

4.3 显色[12]

展开后, 如物质有色, 可明显的在薄层上观察到它们的位置. 如无色, 则要通过一定的方法显色, 定位, 一边确定斑点的位置及大小.

4.4常用溶剂的极性[13]

常用溶剂的极性顺序：石油醚〈环己烷/己烷〈苯〈乙醚〈氯仿〈乙酸乙酯〈正丁醇〈丙酮〈乙醇〈甲醇〈水。

刻画极性一般用介电常数：石油醚（无）（环）己烷（1.88）苯（2.3）乙醚（4.5）氯仿（5.2）乙酸乙酯（6.1）丙酮 （21.5）〈乙醇（25.8）〈甲醇（31.2）〈水（81.0）。

在薄层色谱中, 当溶剂的极性太大时. 会使待分离物全部接近溶剂前沿, 当溶剂的极性太小时, 又会使待分离物几乎全部保留在圆点, 这两种情况都是待分离物得不到分离.

使用单一溶剂，往往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有：Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleum ether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate

4 柱色谱应用实例

5.1 薄层色谱法和柱层析法分离兰州红心萝卜色素的研究[14]

利用薄层色谱法和柱层析法对红心萝卜中的色素进行分离分析，着重研究了色素的量、洗脱剂、洗脱时间等因素对色素分离的影响。选择了以硅胶G 为固定相，无水乙醇/水~(5：1，v/v)的混合液作洗脱剂的最佳条件，单向一次性进行色谱分离。

5.2 常压硅胶柱层析分离制备高纯贝壳杉烷型二萜

从半边旗(Pteris semipinnata L，PSL) 提取物中分离高纯度贝壳杉烷型二萜化合物，建立了分

离工艺条件。以TLC 实验筛选适当的洗脱流动相，常压硅胶柱层析分离纯化，产物用两相法重结晶，TLC 及Ms 监测分离效果及产品纯度。结果表明优选的流动相为混合溶剂石油醚：丙酮：醋酸一7：3：0．05(体积比) ，纯化分离得到两个贝壳杉烷型

二萜单分子化合物，纯度分别从62％和17％提高到96％和94 。

5.3 减压硅胶柱层析分离苦豆子系列生物碱

利用硅胶柱层析法纯化苦豆子中含有的生物碱，以氯仿、甲醇为洗脱剂，通过改变2种溶剂的混合比例进行洗脱，得到了苦参碱、氧化苦参碱和其它生物碱的单体，鉴于其它生物碱无标准品，故本文未加以讨论。苦参碱、氧化苦参碱的得率分别为22．2％ 、42．6％，其单体通过HPLC 检测后，纯度都达到95％以上，因此可以应用硅胶柱层析法精制苦豆子中含有的生物碱。

5.4 中压柱层析法分离白藜芦醇的研究[15]

对虎杖中的白藜芦醇进行了提取分离和含量测定。考察了浸提温度、浸提液浓度、浸提时间和次数、料液比等5个因素对白藜芦醇提取的影响，确立了白藜芦醇最佳提取

条件为：浸提液体积分数为95％ ，浸提温度60℃ ，料液比11：1，回流提取3次，每次60 min。采用中压硅胶柱层析法分离白藜芦醇，产物经重结晶后用高效液相色谱测定含量达99．28％ 。结果表明所建立的制备及分离纯化工艺可用于白藜芦醇的生产.

5.5 干柱层析法制备油茶总皂苷对照品初探[16]

研究干柱层析法制备油茶皂苷对照品的方法。原料用60％ 乙醇超声提取，浓缩至无醇味．石油醚脱酯后用正丁醇按3：1体积比加入萃取。取正丁醇层并真空浓缩至干，干法上样于100目～200目硅胶柱色谱分离，用乙酸乙酯．甲醇．正丁醇．水(2：1：4：7) 的上相展层；根据尺厂值取出相应的条带并用甲醇淋洗收集蒸干，薄层及理化性质检测。该方法所制样品由薄层色谱为一点．纯度较高。该方法简便、实用且制备量大，可作为油茶总皂苷对照品。