关于腐殖酸测定方法的关键比较

关于腐殖酸测定方法的关键比较

Richard T. Lamar 和 Karen H. Talbot

美国犹他州北洛根EarthFax 发展公司

摘要：用比色法，加州食品和农业局（CDFA） 法可以评估八种腐植酸原材料和产品中的腐植酸含量，并通过与经典技术的对比来比较这两种方法。经典方法是用HCL/HF洗涤除去腐植酸提取物中的灰分，并将腐植酸沉淀酸化，然后在稀酸条件下进行腐植酸的提取。与经典过程相比较，比色法和CDFA法都高估了八种样品中的腐植酸含量，分别高估了120%和52%。因此，这些过程并不能得到一个精确可靠的值来表征腐植酸盐中的腐植酸含量和它们的提取物制品。

关键词：腐植 腐植酸 腐植分析 腐植酸分析 CDFA法 比色法

简介：

腐植酸类物质是一系列的大分子物质，颜色呈浅棕色到黑色，分子结构复杂的由二次合成反应生成的异构有机聚合物。根据其在碱性和酸性条件下中提取的溶解度，可将这类物质分为三部分。这些腐植酸（HAs）包括了溶于碱而不溶于酸的一类；和黄腐酸（FAs），此类同时溶于酸和碱；以及既不能在稀释条件下提取也不能在酸性条件下提取的腐殖质一类 。从化学的角度上，这三种类别都很相似，但是其分子量、各种元素的含量、以及所包含的官能团不同。确实如此，从同一来源按顺序提取的腐植酸表现出显著的化学和结构差异。腐植酸和黄腐酸都是从大量的腐殖酸盐中提取得到的，这些腐殖酸盐中包含了各种自然形成的高腐植酸含量的有机岩性物质。这些物质包括风化褐煤、亚烟煤，和各种含碳岩石如泥岩、页岩和粘土岩。腐植酸作为原材料和它们的提取物一道被推向市场，并且销售给农业和园艺社区用作改良土壤，诸如做肥料使用等。

因为腐植酸类物质并没有一个清晰明确的定义和一个与之对应的化学结构式，所以也它没有一个能够准确定量的分析技术。但是，当前有三种由商业化工厂提供的方法可以估计腐植酸盐或腐植酸类物质的腐植酸和腐植酸衍生物含量。这三者都利用了腐植酸在弱碱性条件下的溶解度，其中两者都利用了当碱性提取物遇酸时腐植酸的沉淀作用。这些过程包括定量比色法、CDFA法、CDFA创造的半定量法、还有一种定量法，这篇论文中提到定量法是指基于Swift详细阐明了的过程的修订的经典方法。

比色法比色方法涉及碱性萃取，溶液由0.2M氢氧化钠，0.002胺五乙酸，和2%的酒精。这种方法用于从腐植酸或腐植酸提取物中再提取腐殖酸。此方法通过对比碱性样品提取物和标准量的Aldrich腐植酸的提取物颜色强度来评估

腐植酸的量。然而，因为黄腐酸和其他水溶性物质诸如氨基酸，蛋白质，糖，脂肪酸等同样也被提取出来，所以这种方法并不能单单只是估计腐植酸的含量，而是连同腐植酸，黄腐酸，和其他十分活跃的溶解的成分一同估计在内。

比色法是根据Beer-Lambert法则得来的：log(I0/I)=kcd

在上式中，I0是入射光强度，I是透射光强度。K是物质的消光系数，c是该物质溶解的浓度，d是细胞的路径长度。当细胞长度为1cm且物质浓度为1 mol/L时消光系数k等于吸光度。在相等浓度下，腐植酸化合物的消光系数随分子重量，碳百分含量，凝结读，芳香环和脂肪环中的碳百分含量的增加而增加。因此，如果所有的腐植酸化合物都具有相同的分子重量和化学结构，那么比色法将可以对腐植酸含量进行准确的估计。但是，腐植酸类物质来源广泛，源产地差异很大，分子量大小、浓度、碳含量、芳香环和脂肪环的量都不等。再有，比色法的参照标准是Aldrich腐植酸，由于Aldrich的原因他们的腐植酸统统来源于德国矿山，由降解的植物，泥炭和软碳混合物演变而来。而一批又批被人们提及的Aldrich腐植酸质量很有可能也不一样，且不能作为不同沉淀物中腐植酸提取物的代表。也就是说，根本没有一个标准。

为了准确确定物质的浓度，Beer-Lambert法则依据与标准物质等量的样品的消光系数来对比。这样，通过从测试原料腐植酸并确定其标准消光系数，就可以在一定程度上提高比色法的准确性。标准消光系数一旦确定，腐植酸的浓度就可以被估算。如果黄腐酸和其他光活性较强的物质在分析前被预先除去，提取液中只剩下腐植酸，那么这种技术的准确都会更高。通过酸化提取液至PH

CDFA法使用0.5N 的NAOH来从固体样品中提取腐植酸类物质。一旦提取，就要用浓盐酸将其提取物调节至PH

提取和净化腐植酸的经典方法中需要将固体腐植酸样品溶解在0.1N的NaOH中，或者是用浓NaOH调整液体样品的PH值至11，并且在氮气中过夜沉淀。再通过离心处理将混合物中的未溶解的无机成分除去。再将上清液用浓HCL调节至PH值为2，并静置过夜。将含有腐植酸和无机杂质的混合物再次离心处理，并沉淀，即可收集到无杂质的腐植酸。提纯过程需要将腐植酸在HCL/HF条件下多次洗涤。由于杂质被除去，所以这种方法可以得出腐植酸在腐植酸盐或腐植酸盐提取物中的实际含量。最近，一个基于此方法的快速批量程序做到了在1.5至4个小时内完成多组样品的分析。

本篇论文中所描述的这些工作的目标就是确定比色法和CDFA法是否能够准确地估计腐植酸盐或腐殖酸盐提取物中的腐植酸含量，其基础是通过经典方法来确定腐植酸的量，并且进行比较。另外，我们一直在研究不同的方案来修正比色法，以确定比色法的准确度是否有所提升。

材料与方法

腐植酸盐和腐植酸提取物

八种固体腐植酸矿山或经处理后的腐植酸提取物，称作腐植酸测试因子，它们产于不同的地方并且被用于测试HS/HA（腐植酸类物质或腐植酸）浓度，三种方法的详情如下表。

腐植酸测试方法的重要对比

表一：腐植酸测试因子用来比较比色法、CDFA法，和经典测试法

对腐植酸/腐植酸类物质的含量测定。

腐植酸类物质（HS） 1、北达科他（美国）矿 2、新墨西哥（美国）矿 3、腐植酸盐提取物 4、森诺世混合物 5、腐植酸盐矿 6、爱达荷（美国）矿 7、腐植酸提取物 8、腐植酸提取物

岩性 风化褐煤 亚烟煤 亚烟煤 腐植页岩 亚烟煤 未知

风化褐煤提取物 腐植酸盐提取物

地理位置 北达科他 新墨西哥 新墨西哥 犹他州，埃默里县 犹他州，埃默里县

爱达荷州

北达科他，威利斯顿 加拿大，松木河

矿/提取物 矿石 矿山 提取物 矿石 矿石 矿石 提取物 提取物

比色法测定腐殖物质

为分析腐植酸含量，每一种测试的腐植酸类物质都要分成三份。需事先准

备好由0.2M的NaOH，0.002DPTA，和2%的乙醇组成的提取液。此程序中使用

的标准是Aldrich腐植酸（Aldrich HA）的钠盐。标准曲线绘制如下：分别称取0,25,50,100,200,250,400,500mg的Aldrich HA并置于50mL聚丙烯旋盖瓶中，向每支管中注入20mL提取溶液物，旋转管10s。一小时后，再加入20mL提取物溶液，再次旋转管。混合物在管中静置过夜后，将5mL上清液加入盛有30mL去离子水的干净的50mL聚丙烯管中，旋转混合物。旋转之后透光度为650nm，用LKB Ultraspec 2分光光度计测量。根据标准曲线透光度为650nm处即可找出Aldrich HA 的最初重量。

样品分析时，取3、4、6试管HS各1g，5、7、8试管HS各0.5g，1、2试管HS个0.25g分为三份置于50mL螺旋盖聚丙烯管中。向每支管中加入20mL提取物溶液，盖好盖子，充分旋转15s。一小时后，再加入20mL提取物溶液，再旋转。静置过夜后，取15mL上清液至干净的聚丙烯管中，并同时加入30mL去离子水，充分旋转混合。每份样品其透光度应为650nm，HA的重量有标准曲线得出。

CDFA法测定腐植酸

将经测定后的HS 分为三份，用CDFA法分析过程如下：取1g HS和50mL 0.1N的NaOH置于50mL聚丙烯螺旋盖离心管中。盖好盖子在离心混合器中充分震动1.5h，用5mL 1%的NaOH冲洗盖子，并将冲洗液倒入管中，盖好盖子。1000g 离心20min。 取出上清液置于第二支50mL聚丙烯离心机中。在上述第一个离心管中加入5mL 1% NaOH；旋转至残余物又出现上清液，在像前面说的一样离心。将上清液加入第二支离心机。用6N HCL 将第二支离心机中的混合提取物PH值调至

提取和净化腐植酸和黄腐酸的经典方法

经典方法源自于对Schnitzer法的修改。取1g待测HS于1L 刻度量筒中，

加入1L 0.1N 的NaOH。NaOH与部分溶解的待测HS混合后，将此碱性混合物完全转移至1L锥形瓶中，用磁力搅拌棒搅拌后样品完全溶解。充分混合1-2小时

后，碱性提取物通过离心除去未溶解的矿物质和有机成分。这些过程需要将量筒和锥形瓶的瓶口处填充氮气来排除空气，并且用封口膜密封。用浓HCL将碱性提取物PH值酸化至2.0。锥形瓶瓶口用封口膜密封，并填充氮气，静置24小时。在50mL聚丙烯离心机中含有腐植酸的沉淀与含有黄腐酸的上清液分开。用稀HCL/HF溶液（5mL浓HCL和5mL 25%HF溶解在990mL去离子水中）反复洗涤除去HA中的杂质。向HA中加入20mL HCL/HF， 旋转混合，离心。去掉上清液后，重复两次用稀HCL/HF 洗涤，一次用去离子水洗涤。得到的HA置于离心管中在100摄氏度条件下干燥24小时。将试管实现称好重，再将已净化的HA盛入试管中，在干燥器中冷却至室温。此过程使HA不但干燥，并且保持清洁。

用0.22 mm过滤器过滤被分离出来的含有黄腐酸的上清液，在氮气压力条件下完成。将500mL滤液缓慢通过DAX-8树脂，柱采用蠕动泵。黄腐酸在柱上部被吸收。再用4-6L去离子水从顶部用蠕动泵洗去DAX-8的盐分。DAX-8再返回来用0.1N NaOH洗提以吸收黄腐酸。含有黄腐酸的洗提液利用重力通过Amberlite IR-120氢离子交换柱两次，再用500mL去离子水洗涤。收集滤液并在60摄氏度条件下浓缩。将浓缩后的提取物冻干，干燥，就得到了干净的黄腐酸。

测定腐植酸类物质中的灰分

每份含灰分的待测腐植酸类物质都称取1g样品放入已称重的去陶瓷坩埚中。坩埚都是在80摄氏度下干燥2小时，再在干燥器中冷却至室温。将装有待测腐植酸类物质的坩埚放入马弗炉中加热至650摄氏度，加热24小时。再将坩埚放入干燥器中冷却至室温，通过之前的重量来确定灰分的重量。待测物中的湿分就可以通过重量分析得出。

对改变方法以提高比色法准确度的评价

我们评估了使用新墨西哥产的标准腐植酸和从酸性溶液产品中分离腐植酸的比色法准确性。首先从各种新墨西哥的矿石样品中用经典过程提取和净化腐植酸。净化后的HA与标准Aldrich HA 通过比色法作对比，以估计各种新墨西哥矿山中采集到的各种矿石样品中的HA含量。另外，用浓HCL酸化提取物，再通过离心便可将HA变成沉淀，与酸性上清液隔离开。用40mL提取物再次溶解HA，并旋转。离心后静置10min，在测试提取物。

三份新墨西哥样品都按照比色法处理，并做成相同的副本。完成酸性成分的提取、上清液的分离后，将副本用40mL PH 值为1的去离子水再溶解在40mL 提

取溶液中。在离心10min之前和之后都要使用比色法。标准曲线依据新墨西哥HA或者Aldrich HA的最初重量确定：横坐标取0,25,50,100,200,250,400,500mg。稀释后的提取物透光度对数为650nm。矿石样品的HA浓度取决于标准曲线。

数据分析

HA的含量数据都由比色法、CDFA法和经典过程的应用得到，它们用于分析各种腐植酸原料的主要作用。 这些影响作用的差异取决于Sheffe原理(a = 0.05).

腐植酸测试的主要方法类比

表二 HA分析法对八种腐植酸和腐植酸提取物的HA含量的影响

过程 比色法 CDFA法 经典方法

HA含量(mg/g)a

539 a 310 b 248 c

结果 HA含量

HA含量因方法不同而有很大差异。CDFA法测出的腐植酸含量比经典方法大很多，比色法测出的HA含量又比其他两种方法都打很多。

比色法得出了所有样品的最大值。其得到的HS中的HA含量至有5/8都比CDFA法得到的更大一些。森诺世和爱达荷产的腐植酸原材料数据上都并没有巨大的差异，它们都是低HA含量。而比色法测出的森诺世和爱达荷腐植酸原材料的HA含量还是比经典方法要高一些。

表三 比色法、CDFA法、经典方法测出的腐植酸和腐植酸提取物中的HA浓度平均值 腐植酸/干燥提取物

北达科他

新墨西哥 犹他州 森诺世矿山

比色法 mg/g

1065a 1080a 175a 7a

CDFA法mg/g

514b 600b 128b 1a

经典法mg/g

496b 423c 113b 6a

地球腐植酸原材料

爱达荷矿 威利斯顿 松木河，加拿大

797a 30a 580a 579a 555b 19a 491b 519a 537b 17a 191c 201b

我们可以预期比色法测出的值要比其他两种方法都大，因为它包含了650nm吸收的黄腐酸和其他提取物。一般来说，将CDFA法测得HA含量的值乘以二就是比色法测得HA含量的值。不过这只有对北爱荷华风化褐煤才能使用，也就是八分之一的几率。通过这些数据可以明显观察到，这种做法并不可靠。

通过CDFA得出的值平均比经典法要大55.6%。八种待测腐植酸类物质中的四种都被CDFA法测出了更高的值。这也可以预料得到，因为CDFA法没有除去HA中的灰分，但是经典方法除去了。CDFA法最后的测值比比色法更加接近经典法测值。但是，由于原材料中不同的灰分和提取物杂质，所以CDFA法的测值偏高了很多。

对改变方法以提高比色法准确度的评估

表五给出的是三份新墨西哥矿样品的腐植酸浓度，是由校正过和没有校正过的比色法得出的值。同样我们还给出了经典法测定的HA浓度。通过数据可以看出，比色法始终比经典法高估HA的含量。即使酸化除去650nm处吸收的黄腐酸和其他酸溶性化合物，也还是这样的。实际上，没有通过离心的酸化会使HA含量值比原材料高。

表四 待测腐植酸物质中的腐植酸，棕黄酸，和灰分含量

待测腐植酸类物质 1、北达科他 2、新墨西哥 3、犹他州 4、森诺世

5、地球腐植酸原材料

6、爱达荷矿 7、威利斯顿 8、松木河，加拿大

表五 标准参照物和提取物酸化对于三份新墨西哥（NM） 矿石样品的腐植酸浓度的影响（所有单位为 mg/g）

样品 1-1

经典方法mg/g 547

酸化前 Aldrich NM 620

385

酸化后

Aldrich NM 1003

738

酸化后/cent.

Aldrich NM 858

555

HA mg/g 496

423 113 6 537 17 191 201

HA % 49.6 42.3 11.3 0.6 53.7 1.7 19.1 20.1

FA mg/g 33 38 25 68 89 71 66 47

FA% 3.3 3.8 2.5 6.8 8.9 7.1 6.6 4.7

Ash % 24 29 58 90 39 90 22 62

1-3 2-3 461 563 637 809 402 545 855 1061 580 799 581 803 478 597

样品原始重量为0.5g

通过新墨西哥标准物测得的腐植酸浓度低于用Aldrich 腐植酸标注物。通常，我们用经典过程获得浓度值。用新墨西哥标准物结合样品提取物的酸化和离心，可以得到最为准确的值。比只用经典法要准确一些。

用新墨西哥标准物结合样品提取物的酸化和离心得到的腐植酸浓度在表六中给出。

讨论

最近，腐植酸工业主要应用比色法和CDFA法来测定产品和腐植酸原材料中的腐植酸含量。这篇论文得出的结论说明了这两种方法一般来说都会比经典法更加高估腐植酸的含量，以至于无法准确测定腐植酸原材料和提取物中的腐植酸含量。

表六 通过校正比色法得出的新墨西哥矿石样品的HA浓度 样品 1-1

1-3 2-3

经典法mg/g

547 461 563

改良比色法mg/g

588(47.2) 420(40) 580(28)

由于标准物不够具有代表性，同时在分析波长被吸收的其他物质使得比色法测量不太准确。我们也说明了这种方法的精确度是可以提高的，首先得选用和其他腐植酸或腐植酸提取物相同原材料生产的标准HA，其次要将在给定波长下具有光活性的酸溶性化合物去除掉。要使用改良比色法则要求每种原料生产的标准HA产品都要经过测定。由于标准材料的变动性，总会有新的标注被发掘出来，并取代旧的标准。

CDFA法与经典方法唯一的区别是它没有最后一步的净化灰分过程。如表二所示，去掉这一步骤对HA浓度值有很大影响。因此，加上最后一步的净化会使CDFA测法精度大大提高。

比色法精度的大大提高得益于使用与分析样品同源的标准HA，酸化，和从腐植酸中去除黄腐酸。我们还提出了一下修正方案，使得比色法准确度进一步提高：

1、 准备提取剂时按以下标准：0.2M NaOH， 0.002M DTPA，和2% 乙醇。

每升溶液添加8g NaOH， 0.787g DTPA，和20mL乙醇在1000mL的刻度量筒中，并添加蒸馏水至刻度。

2、 按如下方法准备标准曲线：

a. 放置重0,25,50,100,200,250,400和500毫克的标准HA于50mL的

塑料离心瓶中。

b. 加20mL提取剂，静置1小时。 c. 再加20mL提取剂，静置过夜。

d. 吸取0.3mL上清液，再加入30mL水一起倒入50mL的塑料离心瓶

中，离心。

e. 吸取1mL改溶液到小管中，读出波长为650nm时的透光度。 f. 绘制以HA最初重量为横坐标，透光率为纵坐标的标准曲线。

3、 检测样品如下：

a. 取0.25g腐植酸样品放入50mL塑料离心管中，加入20mL提取剂，

并离心旋转。每种样品准备3支管。

b. 1小时后，再加入20mL提取剂，离心旋转，静置过夜。 c. 用浓盐酸酸化提取剂至PH为2，并离心。倒掉上清液，将用浓HCL

酸化值PH为1的40mL去离子水加入沉淀中，在离心旋转又得到上清液。

d. 离心20min，再加入40mL提取剂再悬浮，并离心20min。 e. 吸取0.3mL上清液，向50mL塑料离心管中加入30mL去离子水，

离心旋转。

f. 吸取1mL溶液至塑料小管，读出波长为650nm时的透光度。 g. 用标准曲线确定腐植酸含量。