农杆菌介导的水稻转化

农杆菌介导的水稻转化

实验目的

学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。

实验原理

随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA 干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。

水稻上常用的遗传转化方法分为DNA 直接导入法和农杆菌介导的转化法。DNA 直接导入法主要包括PEG （polyethylene glycol ）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG 法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA 直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA 的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb ），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。同DNA 直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA 片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。所以已成为转化单子叶植物的首选方法。

一、目标基因对农杆菌的转化

1.1农杆菌感受态细胞的制备

1. 取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM 平板划线，28℃黑暗培养。

2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16小时。

3. 取2ml 菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃，220rpm 振荡培养至OD 600=0.5。

4. 转入无菌离心管，5000rpm 离心5分钟, 去上清液。

5. 加入10ml 预冷的0.1M 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20分钟后，4℃，5000rpm 离心5分钟，去上清。

6. 加入4ml 预冷的含10%甘油的0.1M 的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。

7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf 管中，每管200μl冻存于-70℃。

1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105

取1μg左右的质粒DNA 加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30分钟，-70℃放置3分钟 ，42℃水浴1-2分钟，加入800mlYM 液体培养基28℃，175rpm 摇培2-3小时后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM 平板上，28℃培养。

1.3农杆菌转化子的PCR 鉴定

将农杆菌转化子，用PCR 方法鉴定是否正确转进EHA105中。挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/ml Kanamycin的YM 液体培养基中，28℃，220rpm 摇培16小时，直接用

菌液做PCR 。PCR 所用的引物为pCAMBIA1301载体上特异性的引物FP 35S ：5’-TAC GCA CAA TCC CAC TAT CCT T-3’，RP GUS ：5’-CTG ATG CTC CAT CAC TTC CTG A-3’。 PCR 反应参数设置：

94℃预变性3分钟 后开始以下循环反应：

94℃变性30秒，50℃退火1分钟 ，72℃延伸1分钟，

35个循环后72℃继续延伸10分钟，反应结束后，取20μl反应液在1.0 %琼脂糖凝胶中电泳扩增产物。

PCR 反应体系

母液

农杆菌转化子菌液体

P1

P2

10×PCR Buffer

Mg 2+

dNTP

Taq 酶

H 2O

终体积

2. 根癌农杆菌介导的水稻转化

2.1. 水稻转化受体的准备

2.1.1. 水稻幼胚愈伤组织的诱导培养

取开花后12-15 天左右的水稻幼穗脱粒, 用清水漂去秕粒, 用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用加有几滴Tween20的1.25%的次氯酸钠溶液（活性氯含量为1.25%）浸泡90分钟进行表面灭菌，灭菌时要经常搅拌。用无菌水冲洗3-4次，沥去水备用。在无菌滤纸上用镊子和刮牙器挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基（NB 培养基）上，26℃暗培养诱导愈伤组织。约5-7天后剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基（NB 培养基）上，在相同条件下继代培养5天左右，用于共培养。

2.1.2. 水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养

去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡1-2分钟，然后用0.1%升汞浸泡30分钟，进行表面灭菌(最好在摇床上进行) ，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基上，26℃暗培养。约10-15天后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织, 转入成熟胚继代培养基上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织共培养。

2.2. 农杆菌的培养

将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有50mg/L Kanamycin 的YM 平板上划浓度 2μM 2μM 25mM 2.5mM 5U/μl 体积 2μl 2μl 2μl 2μl 1.2μl 1.2μl 0.2μl 9.4μl 20μl 终浓度 200nM 200nM 1.5mM 150μM 1U

线,28℃黑暗培养2-3天, 用一金属匙收集农杆菌菌体, 将其悬浮于共培养CM 液体培养基中, 调整菌体浓度至OD 600为0.3-0.5, 加入AS ，使AS 终浓度为100mΜ,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

2.3. 水稻愈伤组织与农杆菌的共培养

挑选状态较好（继代培养5-7天、色泽淡黄）的愈伤组织放入100ml 无菌三角瓶中, 加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可), 室温放置20分钟, 并不时晃动。倒掉菌液, 将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液, 随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养2-3天。

2.4. 抗性愈伤组织的筛选

将共培养后的愈伤组织放在含有50mg/lHygromycin的筛选培养基上，26℃暗培养14天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。

2.5. 抗性愈伤组织的分化

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/LHygromycin的分化培养基上, 先暗培养3天, 然后转至15h/d光照条件下培养, 一般经过15-25天左右, 有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。

2.6. 生根、壮苗和移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm 时, 将小苗移到生根培养基上, 培养两周左右。选择高约10cm 、根系发达的小苗，用温水洗去培养基，在温室内移栽入土。水面以不淹没小苗为度，如果天晴，需要遮荫到小苗成活（以吐水为准）。

培养基

诱导培养基 MS （籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.5 mg/L + proline 500 mg/l + glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite

2.6 mg/l pH 5.8

继代培养基 同诱导培养基，但是2,4-D 浓度改为 2.0mg/L

共培养（固体）培养基 MS （籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.0mg/L + CH 500mg/l + 肌醇2000 mg/L + AS 100μM + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite

2.6g/l pH 5.5(液体选择培养基无Gelrite)

选择培养基 MS （籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + 2,4-D 2.0 mg/L + proline 500 mg/l +glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite

2.6 g/l + cef.250 mg/l + Hyg 50 mg/l pH 5.8

分化培养基 MS （籼稻）/N6（粳稻）大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + B5有机 + NAA 0.1 mg/L + KT 4 mg/L + proline 500 mg/l + glutamine 500 mg/l + CH 300 mg/l + 麦芽糖/ 蔗糖 30g/l + Gelrite 2.6 g/l + cef.250 mg/l + Hyg 50 mg/l pH 5.8

生根培养基 1/2 MS/N6大量 + MS-Fe盐 + B5微量 + 蔗糖 30g/l + Agar 0.8% pH

N6（大量） 50ml （20倍）

Ms-Fe 盐 10-20ml （100倍） CH 0.3g/L

B5 macro 10ml （100倍） phytogel 4g/L或 agar 8g/L

B5 vita 10ml （100倍） sucrose 30g/L

proline 0.5g/L glutamine 0.5g/L

终浓度 母液(20倍) 终浓度 母液(20倍)

KNO 3 2830mg/L 56.6g/L MgSO 4.7H 2O 185 mg/L 3.7 g/L (NH4) 2SO 4 463 mg/L 9.26 g/L CaCl 2.2H 2O 166 mg/L 3.32 g/L KH 2PO 4 400 mg/L 8.00 g/L

制备 1 KNO 3, (NH4) 2SO 4, KH2PO 4同时倒入烧杯, 加水搅拌, 使之完全溶解.

2 MgSO 4.7H 2O 先溶于加了100ML 水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中, 边倒边搅, 不能有沉淀.

3 CaCl 2.2H 2O 的配制同MgSO 4.7H 2O

4 配好后放于棕色瓶4℃保存

终浓度 母液(20倍) 终浓度 母液(20倍) KNO 3 1900 mg/L 38g/L MgSO 4.7H 2O 370 mg/L 7.4 g/L NH 4NO 3 1650 mg/L 33 g/L CaCl 2.2H 2O 440 mg/L 8.8 g/L KH 2PO 4 170 mg/L 3.4 g/L

制备 1 KNO 3, NH4NO 3, MgSO4.7H 2O 同时倒入烧杯, 加水搅拌

2 KH 2PO 4先溶于加了100ML 水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中, 边倒边搅, 3 CaCl 2.2H 2O 同KH 2PO 4

4 配好后放于棕色瓶4℃保存

必须单独配制, 否则会沉淀, 用鳌合铁)

终浓度 母液(100倍)

FeSO 4.7H 2O 27.8mg/L 2.78g/L

Na-EDTA 37.5mg/L 3.75g/L

制备 1 FeSO4.7H 2O 溶解于水, Na-EDTA溶解于热水, 将两者混合定容, 于微波炉中加热, 煮沸,

颜色变深, 冷却到室温, 补水, 棕色瓶4℃保存

终浓度 母液(100倍) 终浓度 母液(100倍) 肌醇 100mg/L 10g/l Nico-acid 1mg/l 0.1g/l pyrido(B6) 1 mg/L 0.1 g/l thiamin(B1) 10 mg/L 1 g/l 棕色瓶4℃保存(每次配100ml 为好), 肌醇在配培养基时, 加入到培养基中

KI 0.75mg/L H 3BO 3 3.0mg/L MnSO 4 10mg/L ZnSO 4 2.0mg/L Na 2MnO 4.2H 2O 0.25mg/L

CuSO 4 0.025mg/L CoCl 2 0.025mg/L

用无水乙醇溶解2,4-D 后缓慢加入到H 2O 中, 搅拌, 如产生沉淀, 则重配. 配好后4℃保存

用1N KOH 溶解NAA, 用水稀释定容, 4℃保存

用无水乙醇溶解加H 2O 搅拌, 定容,4℃保存

用HCl 溶解, 加少量HCl 后, 用玻棒研磨成糊状, 再加HCl 使之完全溶解 用DMSO 直接溶解定容19.62mg/ml,分装到无菌小管

用1NKOH 溶解，用水稀释定容到10ml ，过滤灭菌后分装到EP 管中，冰冻保存

KH 2PO 4 0.5g/L Mannitol 10g/L L-Glutamine 2g/L NaCl 0.2g/L MgSO 4 0.2g/L Yeast extract 0.3g/L Agar 15g/L PH=7.0