分光光度法测定纤维素酶酶活

分光光度法测定纤维素酶酶活

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适用范围

本方法适用于纤维素酶酶活的测定。 2

测定原理

纤维素酶在一定温度与pH 条件下，水解纤维素分子中糖苷键，生产纤维素寡糖、纤维二糖和葡萄糖，在碱性条件下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖发生氧化-还原反应，生产3-氨基-5-硝基水杨酸。其产生物在煮沸条件下 ，其颜色深浅与还原糖含量成正比，可用分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。

酶活单位的定义：每1mL 粗酶液，在一定温度和pH 值条件下，1min 水解纤维素产生1μg 还原糖为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3

仪器和设备

3.1 分析天平：精度为0.0001g 。 3.2 紫外分光光度计。

3.3 恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4 PH 计：精度为0.01PH 单位。 4

试剂和溶液

除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1 柠檬酸缓冲液（pH=5.0）

磷酸氢二钠溶液（0.2mol/L）：称取7.16g 磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中，定容至100ml 。 柠檬酸溶液（0.1mol/L）：称取2.1g 柠檬酸溶解于蒸馏水中，定容至100ml 。

取上述配制的磷酸氢二钠溶液24.3ml 、柠檬酸溶液25.7ml 混匀即为柠檬酸缓冲液，其pH 值为5.0。

4.2 羧甲基纤维素溶液（CMC 溶液）

称取2.0g 羧甲基纤维素钠盐溶于200ml 水中，于沸水浴中加热至溶解，过滤，取滤液100ml ，加柠檬酸缓冲液20ml ，蒸馏水40ml ，混匀，储存于4℃条件下备用。 4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液（DNS 试剂）

称取3,5-二硝基水杨酸6.3g 加入到约600ml 水中，逐渐加入氢氧化钠20.8g ，在50℃的水浴中加热搅拌溶解后，再依次加入酒石酸钾钠182g ，苯酚5g 和无水亚硫酸钠5g ，待全部溶解并

澄清后，冷却至室温，用水定容至1000ml ，过滤。滤液储存于棕色瓶中暗处放置7天后使用。 4.4 标准葡萄糖溶液（1mg/mL）

准确称取105℃烘干至恒重的无水葡萄糖250.000毫克，溶于蒸馏水中，定溶至250ml 。 5

分析步骤

5.1 标准曲线的绘制 5.1.1

葡萄糖标准溶液：按表1配置。

表1

分别吸取1mg/ml标准葡萄糖溶液（4.4）2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml ，用水分别定溶至50ml 。再分别吸取上述溶液各10.0ml 于试管中，各加DNS 试剂10ml ，混匀后于沸水中煮5min ，（另作一个对照，取10.0ml 蒸馏水加10mlDNS 试剂，同样煮5min ），冷却后，用分光光度计于530nm 波长处测吸光值（比色皿10mm*10mm），以吸光度为纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 5.2 样品测定 5.2.1

待测酶液的制备

液体酶样：准确吸取样品10.0ml 于100ml 容量瓶中，用适宜溶剂（蒸馏水或者缓冲溶液）定容至刻度。控制稀释样品酶活力在100u/ml—1000 u/ml范围内。

固体酶样：准确称取样品4.0g ，精确至0.0002g 。用适量适宜溶剂（蒸馏水或者缓冲溶液）溶解后，定容至100ml 。再将定容溶液用定性滤纸过滤后，准确吸取10.0ml ，用相应溶剂定容至100ml 。控制稀释样品酶活力在100u/ml—1000 u/ml范围内。 5.2.2

测定

按下列程序操作：

试管A （空白） 试管B （酶试样，需作三个平行试样） 加CMC 溶液8.00 mL 加CMC 溶液8.00 mL ↓ ↓

50±0.2℃保温，3min 50±0.2℃保温，3min

↓ ↓

加DNS 试剂10.00 mL（摇匀） 加酶液2.00mL （摇匀） ↓ ↓

50±0.2℃保温，30min （精确计时） 50±0.2℃保温，30min （精确计时） ↓ ↓

加酶液2.00mL （摇匀） 加DNS 试剂10.00 mL（摇匀） ↓ ↓

沸水煮沸，10min 沸水煮沸，10min ↓ ↓

冷却至常温 冷却于530nm 波长，测定样品葡萄糖浓度 6

结果计算

6.1 液体样品酶活力的计算

从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/ml。样品的酶活力按式（1）计算：

X =

C ⨯20⨯n ⨯1000

（1）

60

式中：X —样品的酶活力（u/ml）

C—由标准曲线读出的还原糖的浓度（mg/ml） n—所测样品稀释倍数 20—检测试样体积（ml ） 1000—将还原糖单位mg 换算为μg

60—将酶液体积换算为1ml ，水解时间换算为1min 。 所得结果表示至整数。 6.2 固体样品酶活力的计算

固体样品的酶活力换算按式（2）计算：

X ⨯V '

X = （2）

m

'

式中：

X ' —固体样品的酶活力，(u/g)；

X —固体样品溶解定容后的酶活力，(u/mL)；

V ' —样品定容体积，ml ；

m —称取样品的质量，g ；

所得结果表示至整数。 7

检验注意事项

7.1 缓冲溶液配制注意事项

缓冲溶液配制完成后，用PH 计测定其PH 值，若PH 值不在规定范围内，需用相应的试剂调PH 值至规定要求。

7.2 多个样品同时检验注意事项

如果有多个样品进行检测，样品处理过程： 预热→加酶液→保温→加DNS 试剂→沸水煮沸 ，需要分别单独进行操作和计时，加酶液及试剂的时间控制在1min 以内。

附则：本方法自2015年5月5日实施。 本方法的编制与修订属于质量管理部。

编制人： 审核人： 批准人：