植物体内转化酶活性的测定

实验五 植物体内转化酶活性的测定

转化酶又称蔗糖酶(β—D —呋喃型果糖苷一果糖水解酶) ，是一种水解酶。植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶。它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆地水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量。所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用，植物细胞代谢及生长强度的指标。

【原理】

转化酶可将非还原性糖的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。将从植物组织中提取的酶液与蔗糖溶液保温作用一定时间后，测定产生的还原糖的量来表示转化酶活性的大小。

在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质) ，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。

通常，在测定过程中，溶液的pH 对酶活性影响很大。不同的酶及不同材料中同一种酶都有其最适的pH 值。转化酶有两个影响水解蔗糖能力的解离基团，一个PKa 约为7，另一个PKa 约为3。不同植物材料的转化酶中这两个基团的含量不同，它们的最适pH 也不同(最适pH 在7.0左右的为中性转化酶，最适pH 在7.0以下的为酸性转化酶) 。所以，在测定材料中转化酶的活性之前，首先要选择适宜的PH 值。如冀棉2号棉铃中纤维和种子部分的转化酶活性的最适pH 为3.5～4.0。

而本实验所选择的材料一棉花叶片中转化酶的最适pH 为 6.0。

【材料、仪器与试剂】

1．材料：棉花叶片

2．试剂，10％蔗糖溶液；葡萄糖标准液(500μg ／ml) ，0.05mol ／L pH6.0的磷酸缓冲液；3，5—二硝基水杨酸：将6.3g 二硝基水杨酸和262ml 2mol ／L NaOH 溶液，加到500ml 含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至l 000ml，贮于棕色瓶中备用。

3．设备

研钵﹑容量瓶(100ml) ﹑台式离心机﹑20ml 刻度试管﹑ 恒温水浴锅﹑分光光度计﹑移液管

【方法与步骤】

1．酶的提取：1 g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100m1，在冰箱中浸提3h ，4000rpm 离心15min(离心机型号LDZ 5—2) ，上清液即为酶的粗提液。

2．酶活性的测定：吸酶液2ml ，放入试管中，再加入pH 6.0的缓冲液5ml 及10%蔗糖溶液1ml ，在37℃水浴锅中保温0.5h ，取出后立即按3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖的含量(见下步) 。以煮沸酶液10min 钝化酶的试管作对照。

3．还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

（1）制作标准曲线：取6支20ml 刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的

5min ，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml ，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD 值。以OD 值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（2）酶反应液中还原糖含量的测定；吸取2ml 反应液，加入1.5ml 3，5—二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5min ，冷却定容至20ml ，测定540nm 处的OD 值。查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

【结果与计算】

转化酶的活性用还原糖量(mg／g·fw·h)表示，计算公式如下：

A 表示转化酶的活性(mg／g·fw·h)，

N 表示酶反应液中还原糖的浓度(μg ／ml) ，

N ﹨表示钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg ／ml) ，

V 表示酶反应液的总体积，

T 表示反应时间，

W 表示材料鲜重。

转化酶的测定

转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。

试剂：

1、10%蔗糖溶液

2、葡萄糖标准液（500μg/ml）

3、0.05mol/l的磷酸缓冲液

4、（DNS ）3，5二硝基水杨酸：将6.3g 二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH 溶液，加到500ml 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml ，贮于棕色瓶中备用。

方法：1、酶的提取：1g 样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml ，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。

2、酶活性的测定：吸酶液2ml ，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml 及10%蔗糖溶液1ml ，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。

3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

①标准曲线：取6支20ml 刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液： 葡萄糖原液量（ml ）

加蒸馏水量（ml ）

葡萄糖浓度（μ

g/ml） 0 2.0 0 0.4 1.6 100 0.8 1.2 200 1.2 0.8 300 1.6 0.4 400 2.0 0 500

在上述各管中分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml ，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD 值。以OD 值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

②酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml 反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm 波长下的OD 值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

4、结果计算：

A=(N-N’)*V/(T*W*1000)

A ：转化酶的活性(mg/gfw/h) N ：酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) N ’：钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) V ：酶反应液的总体积

T ：反应时间 W ：材料鲜重