蛋白质分离纯化方法概况

蛋白质分离纯化方法概况

摘要：分别概述了根据蛋白质分子大小不同、溶解度不同、所带电荷不同这三个方面性质来分离纯化蛋白质的各种技术的原理和特点，并对分离纯化蛋白质的其它方法作了简单介绍。

关键词：蛋白质；分离纯化；方法

蛋白质在生物体内催化代谢反应、物质运转、运动协调、兴奋传导、生长于发育的控制等过程中都起着重要作用。随着生物化学技术的飞速发展，对蛋白质进行分离纯化的各种方法也在不断发展和完善。蛋白质的分离纯化就是利用不同蛋白间内在的相似性与差异，将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来的过程[1]。目前蛋白质的分离纯化方法主要是根据蛋白质分子大小不同、溶解度不同、所带电荷不同及吸附亲和性不同等性质来进行的。

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1.1 基于分子大小不同的分离纯化方法 透析

透析是利用小分子能通过半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。常用的半透膜是玻璃纸、火棉纸和其他改型纤维素材料。透析常和盐析、盐溶等方法联合使用。医疗上用于治疗肾功能衰弱者，工业上用于从人选毛或合成丝厂的纤维废液中回收NAOH[2]。

1.2 超滤

超滤技术是利用加压膜分离的一种技术，其膜孔径范围在0.002～0.02μm，介于微滤和纳滤之间。在一定压力差推动下，溶剂和小分子溶质能透过一定孔径的膜，大分子溶质（蛋白质等）则被超滤膜截留而作为浓缩液被回收。根据不同规格的超滤膜，可以分离出相对分子质量不同的蛋白质。超滤技术具有高效节能、无污染、操作方便、实验条件温和、不需加热等特点，与蒸发、冰冻干燥相比没有相变化，可以防止生物活性物质的变性、失活和自溶[3]。

1.3 密度梯度离心

离心是一种经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。蛋白质颗粒

的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度（区带）离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。根据所需密度和渗透压的范围来选择合适的密度梯度。使用密度梯度离心的方法分离纯化蛋白质，可以消除因对流和机械振动引起区带界面的扰乱。

1.4 凝胶层析

凝胶层析即过滤层析，也称分子排阻层析或凝胶渗透层析，是利用凝胶的网状结构，根据分子大小差异分离蛋白质混合物的有效方法之一。其过程原理为：当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。由于该法上样量有限，常在纯化的最后一步与其他分离方法（如离子交换）组合使用[3]。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。

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2.1 基于溶解度差异的分离纯化方法 等电点沉淀法

等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低且各种蛋白质等电点不同的特点进行分离的方法。蛋白质分子的电荷性质和数量因pH的不同而变化，当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或者全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。通过等电点沉淀的方法分离出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。此法具有操作简单，提取效率高等优点。

2.2 盐溶法及盐析法

盐溶指蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低时，稍加一些无机盐则溶解度增加的现象；而当盐浓度继续增加时，蛋白质又会自动析出，这叫盐析现象。盐溶和盐析主要是通过影响蛋白质分子表面的电荷而分离、纯化蛋白质。盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，常用硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐。硫酸钠具有化学性质稳定、溶解度大等优点，现在所指的盐析法实际上多为硫酸