仪器分析论文

09包装专业仪器分析期末论文

题目：高效液相色谱法原理及应用

姓名：

学号：

指导老师：吴继魁

时间：2012.12.25

高效液相色谱法原理及应用.............................................................................................. 3

一．高效液相色谱法的应用.............................................................................................. 3

1.1高效液相色谱法的分析原理和特点 ....................................................................... 3

1.1.1高效液相色谱法的分离原理........................................................................ 3

1.1.2高效液相色谱法的特点............................................................................... 4

1.2高效液相色谱仪 ................................................................................................... 4

1.2.1高压输液系统............................................................................................. 4

1.2.2迸样系统迸样系统...................................................................................... 4

1.2.4检测系统检测............................................................................................. 5

二．高效液相色谱法的应用.............................................................................................. 5

2.1食品中黄曲霉毒素的测定的测定 .......................................................................... 5

2.2食品中农兽药残留量的测定 ................................................................................. 5

2.3蔬菜水果中农药残留量的测定 .............................................................................. 6

2.4 肉类中残留兽药量的测定 .................................................................................... 6

2.5 食品中各种添加剂含量的测定 ............................................................................. 6

2.6 测定食品中非食用色素 ....................................................................................... 6

2.7食品贮藏过程产生毒素的测定 .............................................................................. 7

2.8在糖类分析中的应用 ............................................................................................ 7

2.8.1低分子糖的分析低...................................................................................... 7

2.8.2 低聚糖的分析 ............................................................................................ 8

2.8.3 多糖的分析 ............................................................................................... 8

小结................................................................................................................................. 8

高效液相色谱法原理及应用

摘要：目前，HPLC 技术在食品安全中起着越来越重要的作用，为人们的食品安全带来了保障。HPLC 技术与其他技术的联用也越来越受到研究者的欢迎，相信在不久的将来，食品检测技术将越来越精细，越来越高效。高效液相色谱法应用于食品分析中能够有效检测食品营养成分、食品添加剂情况以及食品农药残留问题。本文分析了高效液相色谱仪的概况以及分析原理，并着重论述了高效液相色谱法在食品检测中的应用情况。

关键字：高效液相色谱法 食品 原理 检测

引言：现代色谱法从发明到现在已经有近百年的历史。实际上，早在古罗马时代，人们就将一滴含有混合色素的溶液滴在一块布上，并通过观察溶液展开产生的一个个同心圆环来分析染料与色素。100多年前，德国化学家Runge对古罗马人的这种方法作了重要的改进，使其具有良好的重现性与定量分析能力，这项技术后来发展成为今天的纸上色谱技术[1]。1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。此后，高效液相色谱法成为最常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用[2]。 高效液相色谱法（HPLC）是检测食品中添加剂最常用的方法之一, 可同时分离检测多种添加剂，它具有测定范围广、分离效率高、分析速度快和自动化程度强等特点，已成为当今分析科研人员最常用的分析手段。它能进行快速、灵敏、准确的测定，并可与其他分析技术联用，需要的样品量小，而且可配置不同的检测器，因此，HPLC已经广泛地应用于多种防腐剂的同时测定(常见防腐剂结构参见文献[3])。

一．高效液相色谱法的应用

1.1高效液相色谱法的分析原理和特点

1.1.1高效液相色谱法的分离原理

高效液相色谱法是在气相色谱和经典液相色谱法基础上发展起来的。高效液相色谱法是在高压条件下溶质在同定相和流动相之间进行的一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离[4]。

1.1.2高效液相色谱法的特点

从分离原理上讲，高效液相色谱法和经典液相色谱法没有本质的差别，但由于它采用了新型高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，因而使经典的液相色谱法焕发出新的活力。经过近几十年的发展，现在高效液相色谱法在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自化方面，都达到了与气相色谱相媲美的程度。其优点概括如下：采用高效微粒固定相使色谱分离效能大大提高；采用新型高压输液泵使分离时间大大缩短；采用高灵敏度的检测器使仪器的检测灵敏度大大提高；由于HPLC具有高柱效、流动相可以控制和改善分离过程的特点，故其选择性高

1.2高效液相色谱仪

高效液相色谱仪由高压输液系统、迸样系统、分离系统、检测系统和记录仪系统等五大部分组成[5]。其基本的工作流程是：贮液罐中的流动相被高压泵打人系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附一解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

1.2.1高压输液系统

高压输液系统由溶剂贮存器、高压输液泵、梯度洗脱装置等组成。其中高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵。对高压输液泵的要求是：泵体材料能耐化学腐蚀。通常采用普通耐酸不锈钢或优质耐酸不锈钢；能在高压下连续工作。通常要求耐压40 MPdcnr-50MPdcm能在8h—24h连续工作；输出流量范围宽；输出流量稳定，重复性高。

1.2.2迸样系统迸样系统

进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效的送入色谱柱上进行分离。液相色谱的进样方式有利用，进样器与微量注射器进行停留进样，利用天通阀进样，以及利用计算机控制的自动控制定量阀自动进样。

1.2.3分离系统

分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱包括柱管和固定相两部分。柱壁材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内壁光滑的聚合材料的其它金属。一般

色谱柱长10 cm一50 cm，内径为2mm～6 mm，柱形多为直形，柱温一般为室温或接近室温。

1.2.4检测系统检测

高效液相色谱法中的检测器主要用来监视经色谱柱分离后的组分随淋洗液流出的浓度变化，所描记的图形用于进行定性和定量分析，因此，要求检测器应该具有灵敏度高、重复性好、线性范围宽、适应范围广、对流量和温度的变化不敏感等特性。常用的检测器为紫外吸收检测器(UVD)、折光指数检测器(RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。在高效液相色谱中没有通用检测器，实际应用时按需要和结合各种检测器的特点进行选择应用。

二．高效液相色谱法的应用

2.1食品中黄曲霉毒素的测定的测定

黄曲霉毒素(AFT)是一种毒性极强的真菌毒素，目前已分离鉴定的有近20种，是一类化学结构相似的物质，其中以 B1、B2、G1、G2 和M1、M2为主。在天

［］然污染的食品中以B1最为多见，其毒性和致癌性也最强。6建立HPLC测定食

品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的方法，采用ALLSPHERE ODS （250×416 mm）色谱柱，流动相为乙腈/水（梯度洗脱），荧光检测器：激发波长360 nm，发射波长440 nm。结果最低检出的B1、B2、G1、G2分别为浓度0.20 µg/kg，0.05 µg/kg，0.20 µg/kg，0.05 µg/kg。样品进行净化、衍生处理后，用荧光检测器

［7］检测，检出的浓度比国标法提高10倍。

2.2食品中农兽药残留量的测定

为了防止粮食作物和蔬菜水果等的病虫害, 往往在它们的生长期内施加一定的农药。这些农药在收获的果实上的残留量就成为人们关注的问题。尤其是有些有机农药对人体健康的危害不能不引起人们的重视。高效液相色诸法提供了分析残留农、兽药量的一种较好的方法。

2.3蔬菜水果中农药残留量的测定

目前蔬菜水果中不同种类农药的残留测定方法主要是气相色谱法(GC)或气相色谱 －质谱法 (GCMS )，但GC对沸点高或热稳定性差的农药需进行衍生化处理，这样就不可避免地增加了样品前处理的难度，也使它的应用受到一定程

［8］度的限制。等建立了同时测定蔬菜水果12种农药残留的反相高效液相色谱分

析方法。将样品捣碎，用乙酸乙酯超声提取，经Florisil固相萃取柱净化、正己烷二氯甲烷( 1∶1)洗脱、氮气吹干、甲醇溶解并定容后，采用高效液相色谱柱分离、紫外检测，以外标法定量。结果表明：5种有机磷农药、6种拟除虫菊酯类农药和除草剂二甲戊乐灵的检测限为0.114～2.65 ng。应用该法对从市场上随机购买的莲白、小白菜、黄瓜等20个蔬菜样品和苹果、梨等20个水果样品进行检测，其中氧化乐果的检出率分别为55%和45%，辛硫磷的检出率分别为50%和30%，由此可见，国家明文规定的不得用于蔬菜、瓜果的剧毒、高毒农药仍有检出。

2.4 肉类中残留兽药量的测定

激素是由内分泌腺和散在其它器官的内分泌细胞所分泌的微量生物活性物质，动物和人体内正常时含量甚微，残留于动物性食品中的激素常为性激素，当性激素超过人体正常水平时，会破坏机体的正常生理平衡而呈现不良后果。因此对食

［］品中激素残留的测定十分重要。9等研究检测大豆异黄酮类保健食品中三种雌激

素(雌二醇、雌酮、己烯雌酚)含量的分析法。采用Hypersil ODS2 Cl8色谱柱，流动相为甲醇水(体积比53∶47)，流速 1.0 ml/min，检测波长280 nm，该方法的线性范围在 0.5～250 mg/L，三种雌激素的最低检出限分别为0.8、0.9、0.4 mg/L。

2.5 食品中各种添加剂含量的测定

分析测定食品防腐剂的测定，苯甲酸和山梨酸是食品中最常使用的两种防腐剂。对于它们的分析过去常用分光光度法和气相色谱法进行, 但要经过繁杂的预处理操作。近年来发展了高效液相色谱法只需经过简单的处理, 就可直接进行测定。我国秦皇岛卫生检验所的赵惠兰等报导了用高效液相色谱法快速测定饮料中苯甲酸、山梨酸的方法［10］。他们将饮料过滤后直接注入液相色谱系统。10—20min 可同时测定这两种防腐剂及糖精钠的含量。该法的色谱条件是：以uBandapak C18柱为分析柱，含有0.02M醋酸胺的甲醇水（35：65）溶液为流动相, 洗脱速度1ml/min,在 254um的紫外检测器进行检测。该法的回收率97%。标准差为0.29，变异系数为0.038。 武汉市产品质量监督检验所的周胜银、李增也报导了用高效液相色谱法测定酱油及软饮 料类样品中防腐剂的方法［11］。

2.6 测定食品中非食用色素

酸性橙Ⅱ、碱性橙2 和碱性嫩黄O 均为工业染料，用于染丝、麻、皮革等，这3 种物质均可以使人致癌，根据GB2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》

规定，这3 种物质严禁作为品使用。但不法商贩利用其颜色鲜艳、着色稳定、价廉的特点非法添加于豆制品中，使腐竹、豆皮的色泽光亮，欺骗消费者，严重危害了广大消费者的身体健康[12]。：建立食品中的酸性橙Ⅱ、碱性橙2 和碱性嫩黄O 染料残留的高效液相色谱同时测定的方法，样品通过提取之后，采用基质固相分散法净化，然后分别用乙醇和乙醇-氨水-水（7∶2∶1）分步洗脱，最后进行HPLC 分离、检测。此法的回收率平均为79 ％，酸性橙Ⅱ的检出限为0.01 mg/kg、碱性橙2 的检出限为0.02 mg/kg，碱性嫩黄O 染料的检出限为0.01 mg/kg，相对标准偏差平均为3.53 ％[13]

2.7食品贮藏过程产生毒素的测定

一些食品在加工过程中会产生化学变化，生成对人体有害的物质。2002年4月瑞典斯德哥尔摩大学Margareta Tornqvist教授，首次在油炸及焙烤的马铃薯和谷物类食品中发现了具有神经毒性的潜在致癌物——丙烯酰胺(Acrylamide)，该毒物很容易经消化道、皮肤、肌肉或其他途径吸收，并能通过胎盘屏障，是一种公认的神经毒素和准致癌物，已被WHO国际癌症研究中心(IRAC)列为可能致癌物质(ⅡA 类)。2005年4月13日我国卫生部发布了“建议全国消费者避免食用油炸薯片和油炸薯条”的公告，呼吁采取措施减少食品中丙烯酰胺可能导致对健

［14］康的危害。等检测食品中致癌物丙烯酰胺的固相萃取，二极管阵列检测，反

相高效液相色谱测定，用水提取食品中丙烯酰胺，采用C18固相萃取小柱对样品液进行纯化，流动相为甲醇水(体积比5∶95)，DAD扫描波长范围190～370 nm，检测波长210 nm。结果丙烯酰胺在0.1～10 mg/L 浓度范围内线性良好，方法检出限为10 ng/g。用建立的方法分析了59份面包、谷类、豆类、坚果类和土豆类食品，结果显示，食品炸焦的程度越深，则丙烯酰胺含量越高。食品贮藏不当，会引起真菌生长，造成食品的腐败变质，同时有些霉菌产生的霉菌毒素，具有较强的毒性和耐热性。

2.8在糖类分析中的应用

糖是由碳、氢、氧3种元素组成的有机化合物，亦称碳水化合物，根据其分子结构分为单糖、双糖、低聚糖和多糖。食品分析工作者对糖分析方法的要求是既要适用于简单食品，又要适用于复杂加工的食品，而且测定要准确、迅速、可靠。HPLC法测定糖具有明显的优势，并得到了广泛的应用。糖的HPLC测定法主要有两类。一类采用阳离子交换剂或者凝胶柱，以水、醋酸钙溶液或稀酸等作为流动相。第二类是使用化学键合固定相，流动相为乙腈－水。

2.8.1低分子糖的分析低

低分子糖的分析，是指单糖到四糖的分析，食品分析专家要求能准确地测定部分或全部果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖。果糖、葡萄糖、蔗糖的分析可以

提供蔗糖转化的程度及转化糖在产品中的含量;乳糖常作为脱脂奶粉等乳制品的一个主要指标;蔗糖则是最常见的食品成分，这些都是HPLC分析食品中低分子糖的典型例子。用氨基键合相硅胶柱进行低分子糖的分析时，其典型的色谱条件是:柱长15～25cm，流动相为乙腈溶液（乙腈20～80%），检测用示差折光检测器（RID），进样量通常为10～100μL，分析时间一般在20min以内[15]。

2.8.2 低聚糖的分析

低聚糖的分析与上述低分子糖的分析极为相似，同样可用氨基健合柱，但是流动相中水的比例要增加到40～60%，分析时间较长，大约需要30min。近来国内已有不少文献报导。陈洪用HPLC法测定了饴糖中的低聚糖，发现饴糖中的低聚糖以麦芽糖为主，含量为25～39%，另外还含少量的葡萄糖、麦芽三糖和麦芽四糖，葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的最低检出限在微克级。还有文献报导了用高效液相色谱法分析蔗果低聚糖合成液和测定异麦芽低聚糖的组分[16]。

2.8.3 多糖的分析

主要是用于分离纯化及纯度和分子量的测定。过去常用的测定方法有超速离心法、高压电泳法、渗透压法、粘度法和光散射法等。使用这些方法，操作麻烦，结果误差很大。七十年代以后，由于耐高压合成凝胶的出现，HPLC已可用于多糖纯度和分子量的测定以及制备多糖的分离，这样效果更好

小结

高效液相色谱法是吸纳了经典液相色谱法和气相色谱法的优点进行改进和发展起来的现代分析方法，具有分离速度快，测效率高，重现性好的特点。近年在食品分析上应用后，扩大了检测范围，提高了分析水平，尤其对食品中残留的微量、痕量有毒有害物质能快速准确地分析出来，进一步提高了食品卫生质量，保障了食品安全和人民身体健康，促进了食品出口。随着食品工业的发展，人们对食品安全的关注，以及高效液相色谱分析技术的进一步完善，相信其在食品分析中的应用将会更加广泛。

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