苯甲酸钠与溶菌酶的作用机制的研究

目 录

关键词 . ................................................................... 2 引 言 . ................................................................... 2 1 实验部分 . ............................................................... 3

1.1 仪器与试剂 . ........................................................ 3 1.2 实验方法 . .......................................................... 3 1.2.1 荧光光谱的测定 ............................................. 3 1.2.2 同步荧光光谱法的测定 ........................................ 3 2 结果与讨论 . ............................................................. 4

2.1 荧光光谱及荧光猝灭机制 . .......................................... 4

2.1.1荧光光谱 ...................................................... 4 2.1.2 猝灭类型 . ..................................................... 4 2.2 结合位点数n 与结合常数K 的确定 . .................................... 5 2.3 苯甲酸钠与溶菌酶色氨酸残基间结合距离的计算 . ........................ 6 2.4 热力学参数与作用力类型的确定 . ...................................... 7 2.5 苯甲酸钠与溶菌酶间的结合部位 . ...................................... 8

3 结论.................................................................... 9

参考文献 . ..................................................................................................................................10 Abstract .................................................................................................................................... 12 Keywords ................................................................................................................................. 12 致 谢 . ..................................................................................................................................... 13

苯甲酸钠与溶菌酶的作用机制的研究

摘要：在模拟人体生理条件下，采用荧光光谱法研究苯甲酸钠与溶菌酶之间的相互作用，计算了其集合常数、结合位点数，并探讨了苯甲酸钠对溶菌酶构象的影响。研究苯甲酸钠对溶菌酶内源性荧光产生的强烈的猝灭过程为静态猝灭。苯甲酸钠也溶菌酶形成1：1复合物，在308K 温度下的结合常数K 是1.54×105，结合距离r=0.126nm。研究结果表明，苯甲酸钠与溶菌酶的相互作用有重要影响。溶菌酶与苯甲酸钠的同步荧光光谱也表明，溶菌酶的构象在作用前后基本不变。

关键词：苯甲酸钠；溶菌酶；荧光光谱法；同步荧光光谱法

引言

溶菌酶（Lysozyme,LYSO ）是一种存在于生物体内的小分子碱性蛋白，也是生物体

内必不可少的非特异性体液免疫因子[1]，能与许多内、外源物质结合，因而常被用作研究药物小分子与蛋白相互作用的模型蛋白。目前有关溶菌酶的研究较多[2-3]，而其与苯甲酸钠的相互作用的研究尚未见报道。

苯甲酸钠（Sodium benzoate）又称 :安息香酸钠。产品规格：工业级、食品级。分子式:C 7H 5NaO 2 。分子量:144 。其分子结构见图1。

ONa

图 1

性状:白色颗粒或结晶性粉末。无气味，有甜涩味。苯甲酸在常温下难溶于水，在空气（特别是热空气）中微挥发，有吸湿性，大约常温下0.34g/100mL；但溶于热水；也溶于乙醇、氯仿和非挥发性油。在使用中多选用苯甲酸钠；苯甲酸和苯甲酸钠的性状和防

腐性能都差不多。 苯甲酸钠大多为白色颗粒，无臭或微带安息香气味，味微甜，有收敛性；易溶于水（常温）53.0g/100mL左右，PH 在8左右；苯甲酸钠也是酸性防腐剂，在碱性介质中无杀菌、抑菌作用。苯甲酸钠亲油性较大，易穿透细胞膜进入细胞体内，干扰细胞膜的通透性，抑制细胞膜对氨基酸的吸收；进入细胞体内电离酸化细胞内的碱储，并抑制细胞的呼吸酶系的活性，阻止乙酰辅酶A 缩合反应，从而起到食品防腐的目的。苯甲酸钠对人的长期毒性尚不很明确，特别是婴儿是否有把苯甲酸钠转化为马尿酸的转化酶系未知[4]，因此研究苯甲酸钠的毒性具有现实意义[5]。

本文采用荧光光谱法、同步荧光法、紫外光谱法对苯甲酸钠与溶菌酶的相互作用进行了研究，对于理解苯甲酸钠作防腐剂的作用机理有重要的理论和现实意义。

1 实验部分 1.1 仪器与试剂

F-4600荧光仪（日本日立）、PHS-3B 数字酸度计（上海精科）、U-3900紫外分光光度计（日本日立）、FA2004B 电子天平（上海越平科技仪器有限公司）。 苯甲酸钠（天津市北辰方正试剂厂）、溶菌酶（Sigma 公司）、三羟基氨基甲烷 （Tris ） (湖南湘中化学试剂有限公司) 、实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 荧光光谱的测定 移取200μL 8×10-5mol·L -1溶菌酶于10mL 量筒，再分别移取2mL PH=7.4的Tris-HCL 、0.1mol·L -1NaCl 溶液于该量筒中，然后用蒸馏水将该混合液稀释至10 mL。用可调式移液器移取2mL 上述溶液于石英池中，再用可调式移液器移取苯甲酸钠溶液进行荧光滴定，混合均匀后，以280nm 为激发波长，在荧光光度计上记录300～500 nm波长范围内的发射光谱，狭缝宽度均为2.5nm 。

1.2.2 同步荧光光谱法的测定 固定溶菌酶的浓度，逐渐滴加苯甲酸钠溶液，分别在Δλ=15nm和Δλ=60nm下扫描荧光激发光谱，得到溶菌酶中酪氨酸和色氨酸残基的同步荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱及荧光猝灭机制

2.1.1

荧光光谱

在308 K时，苯甲酸钠与溶菌酶相互作用的荧光光谱图见图2。随着苯甲酸钠的浓度的增加，溶菌酶的内源荧光强度有规律地降低，但发射峰形基本不变，说明苯甲酸钠对溶菌酶的荧光有显著地猝灭作用。本文所用荧光强度为考虑稀释效应后的值。

2000

1500

I

1000

500

nm

图2 308 K 时苯甲酸钠对溶菌酶荧光光谱影响

2.1.2 猝灭类型

药物对蛋白质荧光的猝灭主要分为动态猝灭和静态猝灭两类[6]。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程，其作用过程遵循Stern-V olmer 方程[7]： I 0 F /IF = 1 + KSV [Q] = 1 + kq τ[Q] （1）

式中，I 0 F 和I F 分别为溶菌酶和苯甲酸钠作用前后的荧光强度，[Q]为苯甲酸钠的浓度，K SV 为Stern-V olmer 动态猝灭常数，k q 为双分子猝灭过程速率常数，

τ为无猝灭剂存在下荧光分子的平均寿命，生物大分子荧光寿命约为10-8s [8]。有猝灭曲线的斜率即可求得猝灭常数，药物的猝灭常数及线性相关系数r 列于表1。各类猝灭对

生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为 2.0 ×1010 L· mol-1. •s-1 [9] , 显然药物对Lys 猝灭过程的速率常数远大于扩散控制的k q , 可见猝灭过程不是由动态碰撞引起的，而是由于形成了不发荧光的化合物引起的静态猝灭。

由表1可知，体系的K SV 随温度的升高而降低，且苯甲酸钠对溶菌酶的动态猝灭速率常数Kq 远大于苯甲酸钠对生物大分子的最大猝灭常数2×1010 L· mol -1. •s-1，因此可推测苯甲酸钠对溶菌酶的荧光猝灭为静态猝灭。以I 0 F /IF 为纵坐标对苯甲酸钠的浓度[Q]作图，可得线性方程及相关系数，结果见表1。

表1 苯甲酸钠与溶菌酶作用的Stern-Volmer 方程与猝灭常数

2.2 结合位点数n 与结合常数K 的确定

在静态猝灭作用中，荧光强度与猝灭剂的关系可由公式（2）表示[10-11]：

log [(I0 F - IF )/ IF ]= log K+nlog [Q] (2) 以log [(I0 F - IF )/ IF ]对log [Q]作图，结果见图3。

log [(I0 F - IF )/ IF ]

使溶菌酶荧光发生猝灭。

16 800 14 700 12

600

10

500

8

Α400

6

300

4 2002 100 0

[***********]500 nm

图5 308K 时苯甲酸钠的吸收光谱（a ）与溶菌酶荧光光谱（b ）的重叠光谱图

2.4 热力学参数与作用力类型的确定

药物分子和蛋白质等生物大分子之间的结合力主要要疏水作用力、氢键、范德华

力和静电引力等[14]个。不同分子与蛋白质结合力的类型部同。当温度变化不大时，反映的焓变ΔH 可看作常数，热力学参数之间的关系如下[15]:

In(K2/K1) = ΔH ( 1/T1 - 1/T2 )/ R (3) ΔG = -RTlnK (4) ΔS = （ ΔH - ΔG ）/ T (5)

苯甲酸钠与溶菌酶作用过程的熵变效应小于零，构型混乱度减小，吉布斯自由能亦小于零，说明苯甲酸钠与溶菌酶发生了化学反映，且反应是自发进行。根据反应前后的热力

学焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小，可判断药物与蛋白质之间额主要作用力类型：即ΔH > 0,ΔS > 0为疏水作用力；ΔH 0为静电引力[16]。由表2知，反应ΔH

苯甲酸钠与溶菌酶间的结合部位

固定溶菌酶的浓度，逐渐增加苯甲酸钠的浓度，分别固定Δλ=15nm和Δλ=60nm，可得溶菌酶中酪氨酸和色氨酸残基的同步荧光光谱[17-18], 结果见图5。由于Δλ=15nm和Δλ=60n所得同步荧光光谱分别表示溶菌酶中酪氨酸和色氨酸残基的光谱特征[19], 且酪氨酸和色氨酸残基的最大发射波长与环境的极性有关，因此根据最大荧光发射波长的改变可以判断溶菌酶构象的变化。按照实验方法，得到在苯甲酸钠存在下Lys 的同步荧光光谱图（图5、6）。由图5、6可知，随苯甲酸钠浓度的增加，酪氨酸和色氨酸残基发射的荧光都被猝灭，相比之下色氨酸残基荧光强度降低比酪氨酸残基更显著，说明苯甲酸钠—溶菌酶的结合位点更接近于色氨酸残基。

250

200

150

I F

100

50

/nm

图5 Δλ=15m

[**************]0

I F

[**************]00-200

/nm

图6 Δλ=60nm

3 结论

本文在模拟人体生理条件下，采用荧光光谱和同步荧光光谱，研究了不同温度下苯甲酸钠与溶菌酶相互作用的光谱行为。结果表明，苯甲酸钠对溶菌酶的内源荧光存在显著猝灭作用，且猝灭机制为静态猝灭，其结合位点数为1，作用力类型以范德华力和氢键为主。

参考文献：

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Sodium benzoate and lysozyme mechanism of action and structure-activity relationship research

Discipline : Chemistry Name :Yue W enlong Matriculation Number : 08406337

Supervisor :Wang Zhijun

Abstract:Under the simulation human body physiology condition, uses between the fluorescence

spectrographic methods research sodium benzoate and the bacteriolysin mutual function, has calculated its set constant, the union position points, and has discussed the board sodium formiate sodium formate to the bacteriolysin conformation influence.The research sodium benzoate the intense quenching process which produces to the bacteriolysin endocardial fluorescence for static quenching.The sodium benzoate also bacteriolysin forms 1:1 compound, in 308K under temperature union constant K is 1.54×105, the union is away from r is 0.126nm . The findings indicated that, the sodium benzoate and the bacteriolysin mutual function has the important influence.The bacteriolysin and the sodium benzoate synchronization fluorescence spectrum also indicated, bacteriolysin conformation around function basic invariable. Keywords: Sodium benzoate; Bacteriolysin; Fluorescence spectrographic methods; Synchronized fluorescence spectrographic m

致 谢

首先感谢我的指导老师。本论文是在老师的指导下和同学们的帮助下修改完成的。在此，我要向他们的细心帮助和指导表示由衷的感谢。

在这段时间里，我从他们身上不仅学到了许多的专业知识，更感受到他们工作中的兢兢业业，生活中的平易近人。此外，他们严谨的治学态度和忘我的工作精神值得我去学习。

非常感谢大家在我的毕业设计中，给予我极大的帮助，使我对整个毕业设计的思路有了总体的把握，并耐心的帮我解决了许多实际问题，使我有了很大的收获。同时，他们在整个开发过程中提出了许多建设性意见，并给我解决了一些专业性问题。

感谢多年来传授我知识的老师们，更要感谢那些对我学习上支持和鼓励的人。同时感谢所有关心帮助过我的同学、老师。

总之，在以后的学习生活中我将以加倍的努力对给予我帮助的学校、老师及同学们的回报。在此，祝他们永远健康快乐。