细胞生物学实验指导(植物版)

细胞生物学实验

实验一 不同显微镜的使用及细胞一般形态结构的观测

[实验目的]

通过本实验，使学生巩固普通光学显微镜的使用，学习相差显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜的使用方法，学习显微测量及显微摄影的操作方法，增强对细胞的形态和真实大小的感性认识。

通过本实验操作，要求学生掌握细胞形态结构的基本观测方法与技术，为进一步的细胞生物学研究打好基础。

[实验原理]

应用显微镜的成像原理(详见翟中和等主编《细胞生物学》，第三章第一节) ，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，观察细胞形态，得出细胞的大小。

该实验完成需时6学时。

[实验材料、试剂和仪器]

一、仪器

普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、显微拍摄系统、37℃温箱、镜台测微尺、目镜测微尺等。

二、材料

洋葱根尖切片标本，念珠藻永久装片，兔肝细胞标本，夹竹桃花丝毛细胞，人口腔上皮细胞等。

三、试剂

生理盐水，10µg/mL罗丹明123染液（溶于甲醇，避光于4℃保存）

[实验步骤]

一、暗视野显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞

1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。

2、将上述装片置于显微镜载物台上，在10×物镜下找到夹竹桃花丝毛细胞清晰的图像。 3、换上暗视野聚光器，调节至最佳位置，通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，得到最好的暗视野图像效果。

4、观察夹竹桃花丝毛细胞内部的显微结构和细胞质环流现象，并拍照。

5、换用高倍物镜观察时，要换用与高倍镜相匹配的暗视野聚光器，重复以上调节步骤。 二、相差显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞

1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生

理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。

2、将装片置于载物台上，在明视野用聚焦螺旋聚焦样品，将观察到的夹竹桃花丝毛细胞移到视野中央。

3、换上10×相差物镜和相应的相差聚光器，完全打开聚光器的孔径光阑，装上绿色滤光片，调节光源，使视野内亮度均匀。

4、拨出目镜，插入中心望远镜，找到环状光阑的亮环和相板的黑环，调节聚光器，使二者完全重合。

5、拔出望远镜，插入目镜，镜检、拍照。

6、换用高倍相差物镜观察时，要换用与之相匹配的聚光器环状光阑，重复以上调节步骤。

三、荧光显微镜观察人口腔上皮细胞

1、用灭菌的牙签刮取口腔上皮细胞，涂于洁净的载玻片上，滴上一滴罗丹明123染液，于37℃温箱温育30min 。

2、盖上盖玻片，吸去多余的液体。

3、将装片置于载物台上，10×物镜下找到样品焦面，关闭透射光，置于激发光为蓝光、发射绿色荧光的滤片组合块下观察线粒体。必要的话，可换用40×荧光物镜进一步观察、拍照。

四、测微尺的使用操作

1、卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度一面向下装在目镜镜面上，再旋上目镜的上透镜。

2、将镜台测微尺有刻度一面朝上放在载物台上夹好，使测微尺刻度位于视野中央。调焦至看清镜台测微尺的刻度。

3、小心移动镜台测微尺和目镜测微尺(如目镜测微尺刻度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦) ，使两尺左边的"0" 点一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重复的直线(图1) 。

4、记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格的长度等于多少μm

目镜测微尺每格的长度（μm ）=镜台测微尺的格数/目镜测微尺的格数*10

图1 目镜测微尺的标定

上：目镜测微尺，下：镜台测微尺

五、几种不同类型细胞形态的观察及大小测量

1、 观察各种装片标本，注意不同类型细胞的形态及大小差异。

2、 用目镜测微尺和镜台测微尺测量细胞的长、短径或半径的长度，每类被测物测3个 数据，最后取平均值。

[实验结果]

[注意事项]

1、荧光镜下观察细胞时，由于荧光易淬灭，观察时要尽量快。

2、荧光探针都有一定的毒性，因此操作时要注意防止污染皮肤和环境，如弄到手上或桌子上，应及时冲洗。

[实验报告]

1、 完成上述表格。

2、 思考：不同物镜放大倍数下，目镜测微尺每格的单位是否相同？ 3、 思考：不同类型显微镜的适用范围有何不同？

实验二 细胞膜的渗透性观察

[实验目的]

通过本实验，学习、掌握观察、研究细胞膜物质通透性作用的实验方法与技能。了解细胞膜对物质通透性的一般规律。了解溶血现象及其发生机制。

[实验原理]

细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。渗透作用是细胞膜的主要功能之一。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。当红细胞置于不同等渗溶液中时，由于对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子可透入，有的溶质分子则不能透入，能透入的溶质分子的速度也不同。当溶质分子进入红细胞使细胞内溶质浓度增加时，导致水的摄入。当红细胞吸水膨胀到一定程度时，细胞膜破裂，血红素溢出即红细胞发生溶血。由于溶质透入速度不同，溶血时间也不同。

该实验完成需时3学时。

[实验材料、试剂和仪器]

一、仪器

普通光学显微镜、手术刀、秒表、载玻片、盖玻片、吸管、小烧杯、试管等。 二、材料

鸡或鸭血细胞 三、试剂

1.5％氯化钠，生理盐水，0.17 mol ／L 氯化钠， 0.17 mol ／L 硝酸钠，0.12 mol ／L 硫酸钠，0.12mol ／L 草酸钠， 0.32 mol／L 葡萄糖，0.32 mol／L 甘油，0.32 mol／L 乙醇，0.32mol ／L 丙醇。

[实验步骤]

一、红细胞渗透压的观测

1、 取一小烧杯，加入新鲜鸡血，迅速以十倍生理盐水稀释，制成鸡血细胞悬浮液。 2、 取5支试管，编号后依次向各试管加入1.5％氯化钠5，3，2.16，1，0mL ，然后分 别向各试管加入蒸馏水，使每一试管总体积达到5mL ，配成一浓度梯度的氯化钠溶液。

3、 向每一试管加入0.5mL 鸡血细胞悬液，立即轻轻摇匀。 4、 稍停片刻后，观察溶血情况，并记录于表一。

二、红细胞对不同溶质的渗透性观察

1、 取8支试管编号，依次向各试管加入等渗溶液0.17 mol／L 氯化钠， 0.17 mol／L 硝酸钠，0.12 mol／L 硫酸钠，0.12mol ／L 草酸钠， 0.32 mol／L 葡萄糖，0.32 mol／L 甘油，0.32 mol／L 乙醇，0.32mol ／L 丙醇各5mL 。

2、 向每一试管加入0.5mL 鸡血细胞悬液，立即轻轻摇匀。 3、 观察溶血情况，并记录于表二。

[实验结果]

将实验结果记录于表一、二，并加以分析。

表一 红细胞渗透压的观测

表二 红细胞对不同溶质的渗透性观察

[注意事项]

新鲜鸡血提取后要立即稀释，否则会凝固结块，影响后续实验操作。

[实验报告]

完成表一、表二并对实验结果加以分析。

实验三 活体染色及不同细胞结构的观察

[实验目的]

通过本实验，使学生掌握活体染色的基本原理和一般方法，并通过对绿豆根根尖细胞液泡系和洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的活体染色观察、了解液泡系和线粒体的形态及其在细胞中的分布。观察胞间连丝及叶绿体的形态及其在细胞中的分布。

[实验原理]

活体染色是利用某些无毒或毒性较小的染色剂显示出细胞内某些天然构造存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以至引起细胞死亡的一种染色方法。其主要特征是染料的堆积，即染料的胶粒固定、堆积在细胞内某种特殊的构造里面。这种堆积主要是受染料分子的电荷影响。因为碱性染料的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，它们彼此之间会发生电吸附作用（静电吸附）。活体染色的另一特征是专一性。例如中性红只染液泡系，詹纳斯绿－B 只染线粒体，而细胞质和细胞核在活体染色过程中并不被染色。只有当细胞死亡或开始死亡时，细胞质和细胞核才能被染成均匀一致的颜色。

该实验完成需时4学时。

[实验材料、试剂和仪器]

一、仪器

普通光学显微镜（带油浸物镜）、荧光显微镜、DIC 显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、双面刀片、滴管、载玻片、盖玻片等。

二、试剂

Ringer 氏溶液、1/3000浓度的中性红溶液、1/5000浓度的詹纳斯绿－B 溶液 三、实验材料

黄豆（或绿豆）幼根根尖，洋葱鳞片叶表皮细胞，菠菜叶，胞间连丝永久装片

[实验步骤]

一、液泡系的活体染色及观察

1、用双面刀片把初生的黄豆（或绿豆）幼根根尖（约1－2cm 长）小心切一纵断面薄片，放在预先滴有一滴1/3000浓度的中性红溶液的载玻片中央，染色15分钟。

2、用滴管吸去染液，滴加一滴Ringer 氏液，盖上盖玻片，镜检。 二、线粒体的活体染色及观察

1、用镊子撕下一小块洋葱鳞片叶表皮，放在预先滴有一滴1/5000浓度的詹纳斯绿－B 溶液的载玻片中央，染色30分钟。

2、用滴管吸去染液，滴加一滴Ringer 氏液，盖上盖玻片，镜检。 三、叶绿体的观察

1、取一小块菠菜叶，放在预先滴有一滴Ringer 氏溶液的载玻片中央，用镊子将菠菜叶夹碎，盖上盖玻片，镜检。

四、胞间连丝的观察

取一片胞间连丝永久装片，置显微镜下认真观察。 [实验结果]

1、中性红溶液染色结果：可见生长点细胞内有很多大小不等的被染成玫瑰红色的圆形液泡。若观察已分化长大的细胞，可见到较大的液泡，数目较少，有时只有一个浅红色的中央大液泡，其中有些深红色颗粒作布朗运动。

2、詹纳斯绿－B 溶液染色结果：可见线粒体被染成兰绿色，呈颗粒状或线条状，在细胞核周围分布得特别多。

[实验报告]

1、 绘图示黄豆（或绿豆）幼根根尖细胞液泡系。 2、 绘图示洋葱表皮线粒体。

3、 思考：用一种活体染色剂处理细胞，为什么不能同时看到多种细胞器被染色。

实验四 细胞组分的分离与观察

[实验目的]

掌握细胞组分的分离方法（差速离心法）的原理及操作步骤，掌握离心机、组织捣碎机的使用方法。掌握细胞组分的鉴定方法。为进一步研究亚细胞组分的化学组成、理化特性及其功能奠定基础。

[实验原理]

差速离心是指低速与高速离心交替进行，使各种沉降系数不同的颗粒先后沉淀下来，达到分离的目的。沉降系数差别在一个或几个数量级的颗粒，可以用此法分离。样品离心时，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。将细胞充分破碎后，可用差速离心法分离细胞各组份。如用一定的介质进行组织匀浆，然后通过差速离心，先用较低的转速把比重较大的细胞核从细胞质组分及其它碎片的悬浮液中分开，再经过反复洗涤，就能得到纯净的细胞核。再用较高的转速把上清夜中的较小颗粒沉淀下来（如线粒体），从而使各种细胞结构得以分离。为了保护细胞组分的活性，全部操作过程应在0℃~4℃下进行，试剂应置冰箱预冷备用。

叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000r/min离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温下进行分离要迅速。

某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。

该实验完成需时6学时。

[实验材料、试剂和仪器]

一、仪器

冷冻离心机、组织捣碎机、荧光显微镜、普通光学显微镜、解剖针、烧杯、量筒、载玻片、盖玻片等。

二、材料 鸭肝、菠菜 三、试剂

1.5%柠檬酸水溶液、0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液(pH7.4)、0.88mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液(pH7.4)、0.35mol/L NaCl溶液、詹纳斯绿B 染液、0.01%吖啶橙、生理盐水等。

[实验步骤]

一、细胞核与线粒体的分离与观察

1、鸭子饥饿24小时后处死，剖腹取肝，剪成小块，用生理盐水洗干净。 2、称取10g 鸭肝，在冰浴上剪碎，加入100mL 1.5%柠檬酸水溶液，用组织捣碎机充分 破碎细胞（10000－20000r/min，5－10秒/次）。

3、匀浆液用四层纱布过滤，取1.5mL 滤液经1500g 离心10min ，取上清夜，移入高速离心管，保存于有冰块的烧杯中，（待分离线粒体用），沉淀即为粗核沉淀。

4、在上述沉淀中加入1.5mL 1.5%柠檬酸水溶液。离心（同步骤3），弃上清夜，重复步 骤4两次。

5、在上述沉淀中加入1.5mL 0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液，制成悬浮液A ，另取一离心管，加入1.0mL 0.88mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液，然后在其上滴加0.5mL A液，经3000g 离心20min ，弃上清夜，得到较为纯净的细胞核沉淀。

6、在上述沉淀中加入0.2mL 0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液，制成细胞核悬浮液。 7、取一片洁净的载玻片，滴上一滴0.01%吖啶橙荧光染料，然后滴一滴细胞核悬浮液，用牙签混匀，加盖玻片，镜检。

8、将步骤3中保留有上清夜的高速离心管取出，以离心力8000g 离心10min ，弃上清夜，留沉淀。

9、在上述沉淀中加入1.5mL 0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液，悬浮后离心（同步骤8），弃上清夜，留沉淀。

10、在上述沉淀中加入0.2mL 0.25mol/L蔗糖-1.5%柠檬酸水溶液，制成线粒体悬浮液。 11、取一片洁净的载玻片，滴上一滴詹纳斯绿B 染液，然后滴一滴线粒体悬浮液，用牙签混匀，染色5min ，加盖玻片，镜检。

二、叶绿体的分离与观察 1、选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g 于0.35mol/L氯化钠溶液15mL 中置组织捣碎机中。

2、利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，3~5min。 3、用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。

4、取滤液4mL 在1000r/min下离心2min ，弃去沉淀。

5、将上清液在3000r/min下离心5min ，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。

6、沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。

7、取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察。

8、观察叶绿体的形态结构、叶绿体发射荧光的现象。

[实验结果]

普通显微镜下，细胞核呈圆球形，可清楚地看到细胞核内的核仁。线粒体呈颗粒状或线状，被染成兰绿色。荧光显微镜下，细胞核发出绿色荧光。

普通显微镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，内部含有较深的绿色小颗粒－基粒。荧光显微镜下，未染色的叶绿体发出火红色荧光，吸附吖啶橙后发橘红色荧光，其中混有细胞核的发绿色荧光。

[注意事项]

1、为了保护细胞组分的活性，全部操作过程应在0℃~4℃下进行，试剂应置冰箱预冷备用。

2、荧光镜下观察细胞时，由于荧光易淬灭，观察时要尽量快。

3、荧光探针都有一定的毒性，因此操作时要注意防止污染皮肤和环境，如弄到手上或桌子上，应及时冲洗。

[实验报告]

1、绘图表示观察结果。

2、思考题：要获得高活性的细胞组分，在分离过程中有哪些注意事项。 3、思考题：细胞内各组分如何分离？分离原理是什么？

实验五 细胞化学成分的分析

[实验目的]

通过本实验，了解细胞化学方法的基本原理，掌握DNA 、RNA 、酸性蛋白和碱性蛋白在细胞内分布的检测方法。

[实验原理]

细胞化学方法，是在保持细胞结构基础上，利用某些化学试剂和细胞内的某些物质发生化学反应，产生在显微镜下可观察的有颜色的反应产物，从而可对该物质在细胞中的含量及所处位置进行定性与定量分析的一种细胞组分的分析方法。

DNA 经弱酸（1mol/LHCl）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与希夫试剂反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA 的部位呈现紫红色阳性反应。这就是显示DNA 的传统细胞化学方法Feulgen 反应。DNA 和RNA 由于聚合程度不同而对碱性染料有不同的亲和力，可进行选择性染色。由于甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它对聚合程度高的DNA 有强的亲和力，而派罗宁分子只有一个相对正电荷，它仅和聚合程度较低的RNA 结合，因而DNA 和RNA 可被甲基绿和派罗宁分别染色。

由于不同蛋白质分子中所带有的碱性基团和酸性基团的数量不同，在不同的pH 溶液中，整个蛋白质所带的正负电荷也就不同，如在生理条件下，整个蛋白质带负电荷多，则为酸性蛋白质，反之为碱性蛋白。据此，可将标本（经三氯醋酸处理，除去核酸，消除影响因素）用不同pH 的固绿染色液染色，使细胞内的酸性和碱性蛋白分别显示出来。

该实验完成需时6学时。

[实验材料、试剂和仪器]

一、仪器

普通光学显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、吸管、小烧杯、试管、手术刀、解剖剪、镊子、解剖盘等。

二、材料

洋葱根尖、蟾蜍 三、试剂

希夫试剂、亚硫酸水、1M 盐酸、5％三氯醋酸、45％醋酸、70％乙醇、甲基绿－派罗宁混合液、0.1％酸性固绿染液（pH2.0－2.5）、0.1％碱性固绿染液（pH8.0－8.5）、乙醚等。

[实验步骤]

一、细胞内DNA 和RNA 的显示方法 （一）Feulgen 反应

1、切取长约0.5cm 的洋葱根尖末端，在60℃的1M 热盐酸中水解12min ，取出用蒸馏水洗干净。

2、希夫试剂染色30min ，直至根尖出现紫红色为止。 3、用亚硫酸水浸泡2min 。 4、重复步骤3三次。 5、流水冲洗5min 。

6、将根尖放在载玻片上，加一滴45％醋酸，压片镜检。

7、对照：在材料进入1M 热盐酸水解前，用5％三氯醋酸在90℃水浴中处理15min ，消化抽取DNA ，然后按上述各步骤进行。 （二）Brachet 反应

1、取一只经乙醚麻醉的蟾蜍，取血制成血涂片，晾干。 2、70％乙醇固定10min ，晾干。

3、将甲基绿－派罗宁混合液滴于涂片上，覆盖血膜，染色20min 。 4、用清水洗净染液，吸去多余水分，晾干后镜检。

二、细胞内酸性蛋白和碱性蛋白的显示方法

1、取一只经乙醚麻醉的蟾蜍，取血制成血涂片，晾干。 2、取两张晾干的血涂片与70％乙醇固定5min ，清水洗净。

3、将涂片浸于5％三氯醋酸，90℃下处理15min ，清水反复冲洗，直至将三氯醋酸完全冲洗干净。

4、将一张涂片浸入0.1％酸性固绿染液（pH2.0－2.5）染色3min ，清水洗净染液，晾干镜检；另一张涂片浸入0.1％碱性固绿染液（pH8.0－8.5）染色30min ，清水洗净染液，晾干镜检。

[实验结果]

经Feulgen 反应的洋葱根尖细胞细胞质、核仁无色，染色质被染成紫红色。对照组洋葱根尖细胞细胞质、细胞核均无色。

经Brachet 反应染色的蟾蜍血涂片细胞核被染成兰绿色，核仁和细胞质被染成红色。 经酸性固绿染色的蟾蜍血涂片，整个细胞质和核仁中蛋白质被染成绿色。经碱性固绿染色的蟾蜍血涂片，只有细胞核内染色质被染成绿色。

[注意事项]

希夫试剂见光易氧化分解，失去染色能力。因而在实验操作过程中，应注意遮光操作。

[实验报告]

绘图并说明实验结果。

实验六 植物组织培养

[实验目的]

通过本实验，使学生初步掌握植物组织培养的基本操作过程，领会无菌培养对实验材料消毒，接种的要求，初步掌握培养材料灭菌，接种的操作技术。

[实验材料、试剂和仪器]

一、仪器

超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿等。 二、材料

胡萝卜块根，绿豆种子，西瓜种子等。 三、试剂

10%双氧水、酒精、次氯酸钠、无菌水、培养基等。

[实验步骤]

1、准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。

2、将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，同时打开接种室内的紫外灯，用紫外灯照射至少25分钟，然后关室内的紫外灯，开送风开关，关闭台内的紫外灯，通风十分钟后，再开日光灯进行无菌操作。

3、接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。 4、将绿豆种子在流水下冲洗干净。

5、将种子放于200ml 的广口瓶中，用75%的酒精溶液浸泡30s ，无菌水冲洗，然后用10%双氧水浸泡1、3、5min ，期间不断摇动溶液，用无菌水洗涤5遍待用。

6、把培养瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用75%酒精擦洗接种台表面。 7、接种用的镊子使用前插入95%的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也可以插入培养基边缘促使其冷却。

8、在酒精灯火焰旁打开培养瓶盖，将瓶口倾斜接近水平方向，用火焰灼烧瓶口，灼烧时应不断转动瓶口（靠手腕的动作，使瓶口沾染的少量菌得以烧死），左手持瓶，使其靠近火焰，右手将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却，夹取绿豆种子，将其放在培养基上，用镊子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放4-6个外植体。

9、转动瓶口灼烧，将瓶盖从酒精灯火焰上过一下，盖上瓶盖，标上接种日期、材料名称、姓名等。

10、将接种材料移到培养室培养。

[注意事项]

1、从室外取得材料，要用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料，冲洗时间要长，必要时要用毛刷刷洗。

2、外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受力、灭菌剂的

去除等因素, 最好选用两种消毒剂交替浸泡, 初次实验灭菌时间要设置一定的时间梯度来确定最佳的灭菌时间。常用的消毒剂的见下表。

3、工作台接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作（比如说、笑、打喷嚏），以免影响气流，造成污染。另外操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。

4、接种前培养基出现大量污染现象, 若菌类只存在于培养基表面，且主要是真菌时，可能是因培养瓶密封不严或放置培养基的环境不洁净，菌类种群密度过大所致。若菌类存在于培养基内部，则可能是由使用污染的贮藏母液引起。另外培养瓶不洁净，灭菌不彻底也是导致接种前培养基污染的原因。避免此现象发生的方法是:保持环境洁净，杜绝使用污染的母液，严格高压蒸汽灭菌程序，保证灭菌时间。

5、接种后培养基出现大面积污染、菌落分布不匀, 此种情况主要是接种过程中发生的污染所致。可能是接种室不洁净、菌类孢子过多、镊子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸及超净工作台。出现故障等原因引起。避免此现象发生的方法是:保持无菌接种室洁净，并定期用甲醛等熏蒸灭菌；在接种前无菌室用紫外灯灭菌时间不低于20-30 min ；用75%酒精喷雾杀菌降尘，超净台开启15-20 min 后方可使用；镊子等接种工具严格彻底灭菌，且接种时使用1次灭菌1次；操作过程中经常用75%酒精等消毒剂擦洗手部等措施。

6、接种后外植体周围发生菌类污染可能因外植体表面灭菌不彻底所致。解决方法是:外植体用饱和洗涤剂浸泡10-1 5 min，自来水冲洗0 .5-2h后，再选择适宜的灭菌剂消毒，一般用0.1-0.2%升汞灭菌最好。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温一80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，以提高杀菌效果。

植物组织培养中常用的消毒剂

消毒剂名称 使用浓度（%） 消毒难易 灭菌时间（min ） 消毒效果 乙醇 氯化汞 漂白粉 次氯酸钙 次氯酸钠 过氧化氢 [实验结果]

接种后污染调查

观察接种后2～5天的污染情况，填入下表：

70～75 0.1～0.2 饱和溶液 9～10 2 10～12

易 较难 易 易 易 最易

0.1～3 2～15 5～30 5～30 5～30 5～15

好 最好 很好 很好 很好 好

注：污染率（%）=（污染的外植体数/总接种外植体数）×100％

如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短；若接种材料虽然没有污染，但材料已发黄，组织变软，表明消毒时间过长，组织被破坏死亡；接种材料若没有出现污染，生长正常，即可以认为消毒时间适宜。

[思考题]

1、在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种工具，接种材料的污染？ 2、对外植体表面消毒时为什么常用“两次消毒法”？