西方许旺酵母菌及其双加氧酶在烟草增香中的应用

　　摘要：采用响应面试验研究了西方许旺酵母菌（Schwanniomyces occidentalis）及其双加氧酶在烟草增香中的应用情况。结果表明，西方许旺酵母发酵烟叶生成香气物质的最优条件为温度27.8 ℃，水分含量52%，发酵时间7 d，此时烟叶中β-紫罗兰酮含量为2.03 μg/g。生物转化类胡萝卜素生成香气物质的双加氧酶添加量为2.0%，35 ℃条件下，酶解15 h，烟叶中β-紫罗兰酮含量增加31.5%。处理后的烟叶香气质和香气量均有所增加，感官质量明显改善。 　　关键词：西方许旺酵母菌（Schwanniomyces occidentalis）；双加氧酶；烟草；增香 　　中图分类号：TS41+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）21-5612-06 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.045 　　Experiments on Enhancement of the Aroma of Tobacco from Schwanniomyces occidentalis and Dioxygenase 　　ZHENG Jian-qiang，TIAN Shu，TIE Jin-xin，XU Chun-ping 　　（School of Food and Bioengineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002， China） 　　Abstract：The enhancing the aroma of tobacco from Schwanniomyces occidentalis and dioxygenase were studied by response surface test. The results showed that the optimal conditions of flavor components from fermented tobacco with Schwanniomyces occidentalis after culturing 7 days at 27.8 ℃，moisture content 52%. The content of β-ionone was 2.03 μg/g. In addition of purified dioxygenase 2.0%，at 35 ℃ for 15 h，β-ionone content of tobacco was increased 31.5%. The aroma quality had increased after the fermentation，and the sensory quality of tobacco were improved significantly. 　　Key words：Schwanniomyces occidentalis；dioxygenase；tobacco；enhancement 　　烟叶中类胡萝卜素含量与烟叶品质、外观质量密切相关，是烟草香气成分的重要前提物质。烟叶在成熟、调制和醇化过程中，95.0%的类胡萝卜素被降解[1]。类胡萝卜素在氧化降解时，因双键断裂位置不同，可产生不同碳原子数的化合物，进一步形成许多重要的香气物质[2]。降解产生的香味物质阈值相对较低，刺激性小，香气质较好，对烟叶香气贡献率大，如β-大马酮和巨豆三烯酮，这些化合物都是烟叶香气中的典型组成部分，是影响烟叶香气质和香气量的重要组分[3]。烟叶中类胡萝卜素含量与烟叶的香味呈反比，类胡萝卜素在调制、陈化过程中不降解或降解不充分，则烟草产生刺激性强的烟味，导致烟叶的香味不足，烟草制品品质下降。烟叶类胡萝卜素的含量与各项评吸总分呈正相关，在一定的范围内，烟叶中类胡萝卜含量的增加，有利于评吸结果的提高[4]。 　　高质量烟叶中类胡萝卜素类降解产物的含量也高。缪明明等[5]采用化学方法降解类胡萝卜素，对烟草品质进行研究。在烟叶总挥发性香气成分中，含有8%～12%的类胡萝卜素降解产物[6]，有利于增加烟叶的香气质量，评吸结果评分有所提高[7]。类胡萝卜素化学降解产物适合烤烟型卷烟加香，能够增浓烟香、丰满烟气以及改善卷烟醇和性[8]。 　　目前，在国内鲜见采用生物技术的方法降解烟叶中类胡萝卜素产生香味物质，增加卷烟香气的报道。因此，采用生物技术的手段在烟叶陈化期间，降解烟叶中的类胡萝卜素有重要的现实意义。本研究在不改变原来烟叶加工工艺的条件下，仅对局部工序加以调整来完成烟叶的微生物和酶处理的方法，在烟叶醇化工序中进行微生物和酶处理，适当改变陈化后期的温度和烟草中的水分，达到烟叶发酵条件，以期提高降解烟叶中类胡萝卜素生成香味物质的效果。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　菌种：西方许旺酵母菌种（Schwanniomyces occidentalis），郑州轻工业学院食品与生物工程学院实验室分离鉴定菌株。 　　烤烟品种：红花大金元，级别B2F；�a地为云南玉溪。 　　1.2 主要试剂和设备 　　β-胡萝卜素（分析纯）、β-紫罗兰酮（分析纯）（美国Sigma公司）；无水乙醇、石油醚（60～90 ℃）、丙酮（均为分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司生产。 　　安捷伦6890GC-5973MS型气质联用仪（美国 Agilent公司）；UV-2550型紫外可见分光光度计（日本岛津制作所）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 降解β-胡萝卜素双加氧酶的提取 将活化好的菌液按接种量5%接于优化后的发酵培养基中，在初始pH 7.2，28 ℃和160 r/min条件下发酵72 h。通过摇瓶发酵，将粗酶液进行硫酸铵梯度沉淀、半透膜透析、DEAE-Sepharose离子交换和Sephadax G-100凝胶过滤处理，得到电泳纯级别酶。 　　1.3.2 双加氧酶酶活的测定 取5 mL酶液（37 ℃水浴中保温）加入500 μL β-胡萝卜素储备液，加入光程1 cm的玻璃比色皿中，以未加β-胡萝卜素储备液的粗酶液作对照，立刻在450 nm处测定其吸光度，测完后立即在37 ℃避光水浴，每隔1 min测定1次吸光度。酶活力单位定义：在37 ℃，pH 6.5，每分钟降解1 μmol β-胡萝卜素所需的酶量为1个单位。 　　降解率= 　　酶活力=（C0-Ct）×（5.0+0.5）/5.0×t 　　式中，C0为初始β-胡萝卜素含量（μmol/L），Ct为规定时间后β-胡萝卜素含量（μmol/L），t为时间（min）。 　　1.3.3 GC-MS分析条件 色谱条件：毛细管柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度240 ℃；升温程序，50 ℃保持1 min，以8 ℃/min升温到160 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升温到260 ℃，保持15 min；载气（He）恒流模式，流量1 mL/min；进样量2 μL，分流进样，分流比25∶1。 　　质谱条件：电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度160 ℃；质量扫描范围35～455 m/z[9]。 　　1.3.4 烟叶的处理 选择红花大金元B2F（2012）将发酵液均匀喷洒到成品烟丝面上，每100 g烟丝喷加30.0 mL的发酵液（V/W，109 CUF/mL），通过添加去离子水，控制烟叶水分的含量；酶液按照0.5%～2.0%添加。 　　添加发酵液或酶液处理工序：烟叶回潮→喷加发酵液（酶液）→发酵（酶催化）→干燥→切丝→卷制→平衡→评吸。 　　取100 g烟叶在优化温度和水分条件下，把烟叶平铺在不锈钢盘子上，厚度3 cm，放在恒温恒湿培养箱中，避光发酵或者酶催化处理。 　　卷制的烟支在相对湿度60%±2%条件下，温度（22±1） ℃，平衡水分48 h后，进行香味成分分析和感官评吸。对照样品用去离子水代替发酵液或者酶液，相同条件处理。 　　1.3.5 微生物降解烟叶中类胡萝卜素生成β-紫罗兰酮 通过单因素试验研究不同的水分含量（35%、40%、45%、50%、55%、60%）、发酵温度（26、27、28、29、30、31 ℃）和发酵时间（4、5、6、7、8、9、10、11 d）条件下，西方许旺酵母菌株降解烟叶增香效果的情况，以β-紫罗兰酮的含量作为降解类胡萝卜素的产物评价指标，可以间接反映西方许旺酵母酶对烟叶中β-胡萝卜素的影响。采用响应面设计（表1）确定最佳发酵条件，并进行稳定性检验。 　　1.3.6 双加氧酶降解烟叶中类胡萝卜素增香效果分析 研究酶的添加量、发酵温度和发酵时间对降解烟叶中类胡萝卜素而产生增香效果的影响。在25、30、35 ℃下分别加入0.5%、1.0%、2.0%酶液 （V/m，酶浓度1.0 mg/mL），作用不同时间（0、5、10、15、20、25、30 h）后，测定β-紫罗兰酮的生成量。通过分析比较，确定实验室条件下最佳的双加氧酶作用条件，取3次试验的平均值。 　　1.3.7 β-紫罗兰酮含量的提取 采用同蒸法提取β-紫罗兰酮。在同时蒸馏萃取装置的两端分别加入350 mL蒸馏水和60 mL CH2Cl2，同时蒸馏2 h，以清洗同时蒸馏萃取装置，保证仪器洁净。称取30 g（精确至0.1 mg）烟末样品放入同时蒸馏萃取装置一端的1 000 mL圆底烧瓶中，加入适量的氯化钠和蒸馏水，用控温电热套加热，装置的另一端是盛有CH2Cl2的100 mL浓缩瓶，水浴加热，同时蒸馏萃取2.5 h。萃取液浓缩至1 mL，加入浓度为0.600 8 mg/L的乙酸苯乙酯内标。 　　1.3.8 感官评吸方法 发酵或酶催化处理后，制卷烟20支，对照滤嘴卷烟20支采用随机盲法分配法，分别请10位以上专家进行评吸，并根据评吸结果进行总结和评分。判定发酵或酶催化处理前后，卷烟在评吸品质上的改变。卷烟产品的感官质量通常包括光泽、香气、谐调、杂气、刺激性和余味。评吸标准为GB 5606.4-2005。 　　2 结果与分析 　　2.1 微生物对烟叶增香的效果 　　2.1.1 不同发酵温度对β-紫罗兰酮含量的影响 在烟叶中加入30%的菌液，调节发酵温度，研究不同发酵温度对发酵液降解烟叶中类胡萝卜素生成香味物质的影响，测定β-紫罗兰酮含量，结果见图1。从图1可以看出，在一定发酵温度范围内，β-紫罗兰酮含量呈先增加后减少的趋势，当发酵温度在28 ℃时，在酶的催化作用下，β-紫罗兰酮的生成量达到最大值，当温度高于28 ℃时，β-紫罗兰酮含量迅速下降。 　　2.1.2 不同水分含量对β-紫罗兰酮含量的影响 在烟叶中加入30%的菌液，在28 ℃下调节水分含量，研究烟叶中不同水分含量对发酵液降解烟叶中类胡萝卜素生成香味物质的影响，结果见图2。由图2可知，当发酵的水分含量在50%时，β-紫罗兰酮含量最高。水分含量��35%～50%，β-紫罗兰酮含量不断增加，当水分含量达到50%后，由于水分含量的增加，导致酶的活性有所下降，β-紫罗兰酮含量下降。烟叶中水分增加，导致微生物的活动增加，有利于微生物产酶能力的增加；但由于西方许旺酵母是兼性好氧菌，在生长期间需要氧气，随着水分含量的继续增加，烟叶表面颗粒呈团状，不利于氧气的流通，在高水分含量的条件下，空气流通量减少，导致微生物的繁殖速度减缓甚至停止，酶活下降，β-紫罗兰酮含量降低。 　　2.1.3 不同发酵时间对β-紫罗兰酮含量的影响 在烟叶中加入30%的菌液，在28 ℃下研究不同发酵时间对发酵液降解烟叶中类胡萝卜素生成香味物质的影响，结果见图3。从图3可以看出，在烟叶的发酵过程中，前6 d生长较为缓慢，菌体在新环境下适应时间较长，第8天β-紫罗兰酮含量达到最大值，说明第8天酶活性较高，与生长曲线规律基本吻合。 　　2.1.4 响应面试验结果 菌株发酵烟叶条件响应面试验结果见表2，以β-紫罗兰酮含量为检测目标，方差分析结果见表3。由表3可知，模型显著，失拟项不显著，建模成功。模型的决定系数R2=0.959 0，说明模型能解释西方许旺酵母菌降解烟叶中类胡萝卜素生成香味物质的响应值变化情况。该模型与实际情况拟合较好，可用于分析和预测西方许旺酵母菌降解β-胡萝卜素的实际情况。在水平范围内发酵温度对类胡萝卜素降解的影响显著，菌种重复稳定性试验结果较好，说明西方许旺酵母菌稳定性和传代效果较好，不容易变异，对于今后将西方许旺酵母菌运用于工业生产和作为出发菌株的研究具有一定的意义。 　　对试验数据进行多元回归拟合：β-紫罗兰酮含量=2.012-0.023 8×A+0.062 5×B+0.006 25×C+0.01×A×B-0.007 5×A×C-0.005×B×C-0.054 8×A2-0.077 3×B2-0.049 8×C2。 　　通过Design Expert软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析，绘制响应面曲线（图4、图5、图6）。从等高线图可以直观反映出2个变量间交互作用的显著程度，其中圆形表示2个因素交互作用不显著，而椭圆形表示2个因素交互作用显著。由图4、图5、图6可知，发酵温度和水分含量的交互作用对西方许旺酵母菌株降解烟叶β-胡萝卜素生成β-紫罗兰酮的生成量影响显著，发酵温度和发酵时间、烟叶水分含量和发酵时间的交互作用不显著。 　　由图4（a）可知，随着发酵温度的升高，β-紫罗兰酮含量先增加后减少，变化幅度不大；随着水分含量的增加，β-紫罗兰酮含量先增加后逐渐减少，而且减少的幅度较大。主要是发酵温度的升高，使西方许旺酵母菌生长速度加快，迅速达到细胞分裂期，达到对数生长期，使菌种产酶能力增加。酵母菌属于兼性好氧菌，适度的水分含量，适量的氧气含量，对真菌生长有利。水分含量增加，也有利于菌种生长，产酶能力提高；当水分含量过高时，烟叶表面颗粒较小，此时培养基质过度黏结，不利于空气流通，不利于兼性好氧菌菌丝体的生长，水分含量过大，造成培养基质中菌丝体数量大大减少，导致菌种产酶能力降低。 　　由图5可知，在发酵期间，β-紫罗兰酮的含量随着发酵温度的变化先增加后减少。 　　由图6可知，在所考察范围内，发酵时间和水分含量对β-紫罗兰酮的生成量影响不显著。 　　由响应面曲线可知，响应值存在最大值。通过软件分析计算得出理论最佳优化条件：发酵温度27.8 ℃，水分含量52%；发酵时间7 d，此时β-紫罗兰酮含量为2.03 μg/g。在此发酵条件下，重复试验3次，西方许旺酵母发酵烟叶生成β-紫罗兰酮的含量为1.98 μg/g，与预测值相差0.05 μg/g，说明该方程与实际情况的拟合性良好，能够反映发酵温度，水分含量和发酵时间对β-紫罗兰酮生成量的情况。 　　2.1.5 降解前后β-紫罗兰酮含量及烟叶香味成分分析 对发酵前和发酵后烟叶中的香味物质进行提取，并进行GC-MS分析，研究香味成分变化情况。经GC-MS数据分析，发酵前后主要相关香味物质含量见表4。 　　从表4可以看出，经西方许旺酵母发酵液处理后的烟叶中，β-紫罗兰酮含量增加了0.52 μg/g，增幅为35.62%，二氢猕猴桃内酯增加了0.17 μg/g，增幅为21.52%。异佛尔酮、β-二氢大马酮等香味成分含量增加。表明西方许旺酵母菌能够降解烟叶中的β-类胡萝卜素生产β-紫罗兰酮等香味物质，同时烟叶中除了β-胡萝卜素，还有叶黄素、新黄素和紫黄质等香味物质前体成分。通过化学氧化方法，叶黄素可降解产生异佛尔酮、巨豆三烯酮等香味成分。叶黄素在含氧氛围中，C9=C10双键发生断裂，可以生成3-羟基-α-紫罗兰酮（3-hydroxy-α-ionone），经氧化还原生成3-氧代-α-紫罗兰醇（3-oxo-α-ionol），再经脱水形成巨豆三烯酮。C6=C7双键发生断裂，可生成至关重要的香味物质氧化异佛尔酮[10]。因此，异佛尔酮、巨豆三烯酮含量的增加，可能是由西方�S旺酵母生成的双加氧酶氧化叶黄素产生的。金合欢基丙酮、β-二氢大马酮和β-大马酮可能是该酵母菌种产生的双加氧酶降解其他类胡萝卜素生成的香味物质。 　　2.2 双加氧酶对烟叶的增香效果 　　2.2.1 添加酶液降解烟叶中类胡萝卜素生成β-紫罗兰酮 从图7、图8和图9中可以看出，烟叶中β-紫罗兰酮含量随着酶作用时间的延长而增加，开始10 h内，β-紫罗兰酮含量快速增加，随后β-紫罗兰酮含量增加速度变慢，15 h以后，β-紫罗兰酮含量变化很小。随着酶量的增加，烟叶中β-紫罗兰酮的增加量也快速增加，但是加入过多的酶液会使烟叶中蛋白质含量增加，影响烟叶评吸感官质量。 　　温度对双加氧酶降解烟叶中类胡萝卜素生成β-紫罗兰酮含量也有很大影响，25 ℃时，在烟叶中加入2.0%的酶液反应15 h后，β-紫罗兰酮含量增加了15.7%；30 ℃时，在烟叶中加入2.0%的酶液反应15 h后，β-紫罗兰酮含量增加了28.1%；35 ℃时，在烟叶中加入2%的酶液反应15 h后，β-紫罗兰酮含量增加了31.5%。可见在35 ℃时酶液的降解情况较好，温度过高还会引起降解产物中香味物质挥发，造成香味成分的改变，所以选用35 ℃作为酶液的作用温度。 　　2.2.2 发酵前后感官评析比较 发酵烟叶前后评吸结果见表5。发酵后，卷烟香气清雅、尚丰富，稍有刺激性，协调性较好，稍有杂气，余味基本舒适；对照卷烟香气饱满、稍粗糙，略有刺激性，基本协调，略有杂气，余味欠舒适。由表5可知，评吸效果的提高，主要是发酵后的烟叶中β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等香味成分含量的增加，有利于提升感官评吸效果。发酵后的卷烟制品香气量增加，烟气给人清爽感，并在吸味上减少烟气的干燥性，提高卷烟吸食品质的效果，使烟香变得细腻柔和，提高卷烟吸食品质的效果。 　　3 小结 　　通过响应面试验得到发酵时间、发酵温度和水分含量对β-胡萝卜素降解生成β-紫罗兰酮的二次多项回归方程模型，方差分析说明该方程能够很好地解释香味物质随各参数变化的规律。最佳优化条件为温度27.8 ℃，水分含量52%，发酵时间7 d，此时β-紫罗兰酮含量为2.03 μg/g，结果稳定可靠。表明发酵后的烟叶香味物质含量明显增加，通过感官评吸试验证明，发酵后的烟叶感官质量明显改善。 　　酶解类胡萝卜素生成香味物质的适宜条件是双加氧酶添加量2.0%，35 ℃酶解时间15 h，可增加烟叶中β-紫罗兰酮31.5%，有效地改善卷烟的香气质量。 　　参考文献： 　　[1] 邵惠芳，李爱军，代惠娟，等.烟草质体色素研究进展[J].中国农学通报，2007，23（12）：128-132. 　　[3] BRADLY D G，M IN D B.Singlet oxygen oxidation of foods[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1992，31：211-236. 　　[3] MELENDEZ-MARTINEZ A J，STINCO C M，LIU C，et al. 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