硫酸铵盐析法分离罗非鱼肌红蛋白的研究

第５卷第２期２００９年４月

ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－２２２７．２００９．０２．００３

南方水产

Ｖ０１．５，Ｎｏ．２

ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＦｉ８ｈｅｒｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅＡｐｒ．，２００９

硫酸铵盐析法分离罗非鱼肌红蛋白的研究

何俊燕１，一，李来好２，郝淑贤２，杨贤庆２，马海霞２，岑剑伟２，石

广东广州５１０３００；３．华南农业大学生命科学学院，广东广州５１０６４２）

红２，胡强初３

（１．广东海洋大学食品科技学院，广东湛江５２４０２５；２．中国水产科学研究院南海水产研究所，

摘要：通过测定盐析液的色泽、肌红蛋白含量、纯度、回收率和吸收光谱等的变化情况，分析了硫酸铵分级盐

析过程对罗非鱼肌红蛋白分离的影响。研究表明，硫酸铵饱和度为６０％一１００％可导致肌红蛋白沉淀析出，其中饱和度为５０％时，肌红蛋白纯度为３７．５２％，回收率仅为３９．８９％；饱和度大于６０％时，肌红蛋白纯度虽有所降低，但回收率逐渐提高，当饱和度为１００％时，回收率最高为８７．５６％。在盐析过程中，部分氧合肌红蛋白氧化成为高铁肌红蛋白。

关键词：肌红蛋白；罗非鱼；硫酸铵；分离中图分类号：ＴＳ２５４

文献标识码：Ａ

文章编号：１６７３—２２２７一（２００９）０２—００１７—０６

Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｙｏｇｌｏｂｉｎｆｒｏｍｔｉｌａｐｉａｂｙａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅｓａｌｔｉｎｇ－ｏｕｔ

ＨＥＪｕｎｙａｎｌ＇－，ＬＩＬａｉｈａ０２，ＨＡＯＳｈｕｘｉａｎ２，ＹＡＮＧＸｉａｎｑｉｎ９２，

ＭＡＨａｉｘｉａ２，ＣＥＮＪｉａｎｗｅｉ２，ＳｈｉＨｏｎ９２，ＨＵ

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅｏｆ

２．Ｓｏｕｔｈ

Ｆｏｏｄ

ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＯｃｅａｎ

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｚｆｍ慨５２４０２５，Ｃｈｉｎａ；。

５１０３００，Ｃｈｉｎａ；

Ｑｉａｎｇｃｈｕ３

ＣｈｉｎａＳｅａＦｉｓｈｅｒｉｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｉｓｈｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ３．Ｃｏｌｌｅｇｅ

ｏｆ嘶Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈ

ｓａｌｔｉｎｇ－ｏｕｔ

Ｃｈｉｎａ

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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｎｕｎｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ

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ａｔｓａｔｕｒａ・

ａｎｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒａ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｙｏｇｌｏｂｉｎｃｏｕｌｄｂｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄａｆｔｅｒｔｒｅａｔｉｎｇｗｉｔｈａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ６０％一１００％，ａｎｄｔｈｅｐｕｒｉｔｙａｎｄｒｅｃｏｖｅｒｙｐｕｆｉｔｙ

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３７．５２％ａｎｄ３９．８９％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｆｔｅｒｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ５０％ａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ．ｉｎｃｒｅａｓｅｄｇｒａｄｕａｌｌｙｗｈｅｎｔｈｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎＷａｓｇｒｅａｔｅｒｔｈａｎ６０％．Ａｎｄｒｅｃｏｖｅｒｙ

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８７．５６％ｗｈｅｎｔｈｅｓａｔｕｒａｔｉｏｎｒｅａｃｈｅｄ

１００％．ＯｘｙｍｙｏｇＩｏｂｉｎＷａｓｐａｒｔｌｙｏｘｉｄａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｍｅｔ—ｍｙｏｇｌｏｂｉｎｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓ

ｏｆｔｈｅａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅｓａｌｔｉｎｇ－ｏｕｔ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ；ｔｉｌａｐｉａ；８ｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ；ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ

肌红蛋白由一个球蛋白分子和含铁血红素分子ｄｅｏｘｙ－ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ）、氧合肌红蛋白（Ｍｂ０２，ｏｘｙ—ｍｙ－

ｏｇｌｏｂｉｎ）和高铁肌红蛋白（ｍｅｔ－Ｍｂ，ｍｅｔ－ｍｙｏｇｌｏ・

组成，其存在形式有脱氧肌红蛋白（ｄｅｏｘｙ—Ｍｂ，

收藕日期：２００８—１１－０４；修回日期：２００８—１２－０２

资助项目：国家自然科学基金项目（３０６７１６３１）；农业部“９４８”引进项目（２００６－Ｇ６４０）；广东省自然科学基金项目（０６０２３３５２）作者简介：何俊燕（１９８３一），女，硕士研究生。从事水产品质量安全研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｃｊｔｍｙａｎ２１２＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：李来好，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌａｉｈ∞ｌｉ＠１６３．ｃｏｍ

１８

南方水产

第５卷

ｂｉｎ）。罗非鱼暗色肉存在于鱼体侧线的表面及背侧和腹侧之间，肌纤维稍细，富含Ｍｂ和Ｈｂ等色素

蛋白质…，在放血充分的条件下，肌红蛋白在肌肉中的比例可达到８０％一９０％，是构成肉色的主

要因素忙Ｊ。它主要负责将毛细血管的氧贮存并扩

散到细胞组织内部。这部分肉与空气接触短时间内色泽即会变暗。随着时间的延长，肉色呈褐色，一定程度上影响人们的购买欲。为了揭示鱼肉色泽变化机理，从而提出合理控制鱼片色泽变化的措施，有必要对罗非鱼肌红蛋白进行提取及分离研究。盐析法作为一种重要的研究手段，在实验室中常被用来分离蛋白质，特别是对原料的初步分离。而硫酸铵是盐析最常用的无机盐，它具有溶解度大，随温度变化小，对蛋白质有保护作用，高浓度时可抵制微生物和蛋白酶的活性，价格低等优点旧Ｊ。该试验旨在了解硫酸铵分级盐析过程中罗非鱼肌红蛋白的变化情况，通过盐析液色泽变化、吸收光谱以及聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析肌红蛋白的纯度，确定分离罗非鱼片肌红蛋白所需的硫酸铵饱和度区间。

１材料与方法

１．１材料

原料鱼为鲜活罗非鱼，购于广州市海珠区大江苑市场，体重约６５０＋５０ｇ。

１．２药品和试剂

酪蛋白、马肌红蛋白（ＳＩＧＭＡ公司产品）；低分子量标准蛋白（上海普欣生物技术公司产品）；

Ｔｒｉｓ

ｂａｓｅ（Ｍｅｃｈｅｍ）；盐酸、硫酸铵等（分析纯，

广州化学试剂厂产品）。１．３试验方法

１．３．１肌红蛋白（Ｍｂ）的提取

称取一定量切

碎的罗非鱼片暗色肉，加入７倍体积０．０５

ｔｏｏｌ・

Ｌ～、ｐＨ

８．４的嘣ｓ—ＨＣｌ缓冲液，匀浆约１０

ｓ，冰

浴提取０．５ｈ，４℃、１５０００

ｇ冷冻离心１５ｍｉｎ，过

滤后取上清液，即为Ｍｂ的粗提液，备用。

１．３．２

肌红蛋白（Ｍｂ）的盐析

将固体（ＮＨ。）２ｓＯ。缓慢加入至１５

ｍＬ

Ｍｂ粗提液中，饱和

度分别为４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％

和１００％，充分沉淀后离心，离心条件为１５

０００ｇ、

４。Ｃ、１５ｍｉｎ，取上清进行色泽、总蛋白和肌红蛋

白浓度测定；同时将沉淀用１５

ｍＬ０．０５ｍｏｌ・Ｌ～、

ｐＨ

８．４的ｒｉｆｆｓ—ＨＣｌ缓冲液溶解，然后测定色泽、

总蛋白和肌红蛋白浓度。１．３．３测定方法

（１）Ｍｂ含量的测定。参考ＢＥＮＪＡＫＵＬ和

ＢＡＵＥＲＨｏ的方法，测定样品在５５５

ｎｍ的吸光值，

试验重复３次。Ｍｂ含量计算如下：

Ｃ＝ＭＸＡ５５５／（７．６×ｌ０００）

其中ｃ为溶液中肌红蛋白浓度ｍｇ・ｍＬ～，Ａ为吸光度值，毫摩尔消光系数为７．６，Ｍ为摩尔分子量。

（２）色泽的测定。用ＣＩＥＬ。ａ’ｂ’系统测定盐析前后样品的亮度（Ｌ‘）、红绿色值（ａ。）和黄蓝色值（ｂ‘）。

（３）总蛋白浓度的测定ｂ］。采用双缩脲法测定盐析后上清液和沉淀中的总蛋白浓度，酪蛋白为标准蛋白。总蛋白含量通过以下公式进行计算：

样品中的蛋白质含量＝毒品要黜

（４）肌红蛋白纯度和回收率的计算。根据肌红蛋白和总蛋白含量计算结果，按下式计算肌红蛋白的纯度和回收率：

纯度＝涨ｘ回收率＝嚣器枷。％

１００％

（５）波谱扫描。应用紫外可见分光光度计对Ｍｂ各饱和度盐析液进行扫描，扫描范围为３８０—４５０和４５０—７００ｎｍ，扫描速度为６００

ｎｍ・ｒａｉｎ～。

（６）ＳＤＳ—ＰＡＧＥ鉴定纯度。试验参照ＬＡＥ—ＭＭＨ【６１的方法，略作改动。采用垂直电泳，浓缩胶浓度４％，分离胶浓度１５％。电泳结束后取出胶板用０．０２％（Ｗ／Ｖ）的考马斯亮兰Ｒ－２５０染色，然后分别用甲醇：冰乙酸为５０％：７．５％和５％：

７．５％２步脱色［７］，采用凝胶成像仪拍照。

１．４统计分析

采用统计软件ＳＰＳＳ１２．０对试验数据进行统计

第２期

何俊燕等：硫酸铵盐析法分离罗非鱼肌红蛋白的研究

１９

分析。各组数据经过正态性检验、方差齐性检验和独立性检验后，符合参数统计的要求后进行分析。均值比较采用独立样本ｔ检验，单因素方差分析

（Ｏｎｅ—ｗａｙ

ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ

ｖａｒｉａｌｌｃｅ）采用ＬＳＤ法。

２结果与分析

２．１

盐析过程中色泽变化情况

该试验采用ＣＩＥＬ’ａ’ｂ＋系统测定不同硫酸铵饱和度盐析过程中上清液和沉淀的色泽变化情况。据测定结果（图１～图３）可知，随着硫酸铵饱和度的增大，Ｍｂ粗提液经硫酸铵盐析前后的上清液和沉淀的Ｌ’、ａ’和ｂ’值均有显著的变化。Ｌ’反应样品溶液的亮度，随着硫酸铵饱和度增加，沉淀的Ｌ‘显著减小，上清液的Ｌ＋显著增加（Ｐ＜

０．０５）；ａ＋反应样品的红色值，是３个色值中最能反映肌红蛋白变化情况的指标，随着硫酸铵饱和度

的增加，沉淀的ａ＋增大，上清液的ａ‘减小；ｂ＋反

应样品的黄蓝色值，随着硫酸铵饱和度增加，沉淀的ｂ‘显著增大，上清液的ｂ＋显著减小（Ｐ＜

０．０５）。Ｌ‘和ｂ。在硫酸铵饱和度为０％一１００％间均有显著性差异（Ｐ＜０．０５），而ａ‘的变化则略有

不同，硫酸铵饱和度为４０％与５０％的盐析上清液

的ａ’间无显著性差异（Ｐ＜０．０５），饱和度大于６０％时，ａ＋变化最为明显（Ｐ＜Ｏ．０５）。

７０

６０

ｏ５０

４０

３０

Ｏ

４０

５０

６０

７０

８０

９０

１００

ＡＳ饱和度／％

ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ

ｏｆ（ＮＩＬ）２ＳＯ，图

ｌ

各种硫酸铵饱和度下Ｍｂ溶液Ｌ’的变化

Ｆｉ昏１

ＣｈａｎｇｅｓｏｆＬ’ｏｆｍｙｏｇｌｏｂｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎｖａｒｉｏｕｓ

ｓａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ

２．２盐析过程中肌红蛋白含量变化情况

硫酸铵能够降低蛋白质的水合程度，降低其溶解度，从而使蛋白质沉淀出来。不同饱和度的硫酸

铵处理后的上清液及沉淀中肌红蛋白含量的变化情况见图４。结果表明，随着硫酸铵饱和度增加，沉

淀中肌红蛋白析出量逐渐增多，上清液中肌红蛋白

含量逐渐减小。饱和度于６０％～８０％之间肌红蛋白变化情况趋缓，当浓度大于８０％后，肌红蛋白

析出情况再度明显。孙京新等哺１采用饱和度７０％一１００％硫酸铵分离猪肉氧合肌红蛋白，徐群英

１６

１２

．一８

４

００

４０

５０

６０

７０

８０

９０

１００

ＡＳ饱和度／％

ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ

ｏｆ（ＮＨ．）２ｓｏ．

图２各种硫酸铵饱和度下Ｍｂ溶液ａ‘的变化Ｆｉ昏２

Ｃｈａｎｇｅｓｏｆ

ａ‘ｏｆｍｙｏｇｌｏｂｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎｖａｒｉｏｕｓ

ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ

ｏｆａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅ

２５

２０

１５

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５

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ｆ

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４０

５０

印

７０８０９０ｌＯ

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ＡＳ饱和度／％

ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ

ｏｆ（ＮＨ・）２ＳＯ・

图３各种硫酸铵饱和度下Ｍｂ溶液ｂ‘的变化Ｆ谚３

Ｃｈａｎｇｅｓ

ｏｆｂ’ｏｆｍｙｏｇｌｏｂｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎｉｎｖａｒｉｏｕｓ

ｓａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆａｍｍｏｎｉｕｎｌｓｕｌｆａｔｅ

２０

南方水产

∞

第５卷

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ＡＳ饱和度／％

ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ

ＡＳ饱和度，％

ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ

ｏｆ（ＮＨ，１２Ｓ０・

ｏｆ（ＮＨ．ＸＳｏ．

图４硫酸铵分级盐析肌红蛋白含量的变化Ｆｉ昏４

Ｃｈａｎｇｅｓｏｆ

图５硫酸铵分级盐析肌红蛋白纯度和回收率的变化

Ｆｉｇ，５

Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｍｙｏｇｌｏｂｉｎｐｕｒｉｔｙａｎｄｙｉｅｌｄ

ａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅｓａｌｔｉｎｇ

ｏｕｔ

ｒａｔｅ

ｍｙ刚ｏｂｉｎ

ｃｏｎｔｅｎｔｏｕｔ

ｉｎａｍｍｏｎｉｕｍ

ｉｎ

ｓｕｌｆａｔｅｓａｌｔｉｎｇ

等一１用饱和度大于８０％的硫酸铵分离金枪鱼肌红蛋白。

２．３盐析过程中肌红蛋白纯度和回收率变化情况

由于不同蛋白质的表面极性基团数目和分布不同，随着硫酸铵饱和度的增加，各种蛋白质溶解度的变化略有差异。为了确定盐析分离罗非鱼肌红蛋白的最佳方法，对盐析过程中肌红蛋白纯度及回收率的变化情况进行研究，结果见图５。在盐析初期，肌红蛋白回收率急剧升高，当硫酸铵饱和度大于６０％后，回收率增加缓慢，当硫酸铵饱和度为１００％时，回收率最高，为８７．５６％。与肌红蛋白回收率存在明显不同的是随着硫酸铵饱和度的增大，沉淀中肌红蛋白纯度先增加后降低。当硫酸铵饱和度为５０％时，沉淀中Ｍｂ纯度最高，为

３５３Ｏ２５

３７．５２％，而后逐渐下降，这表明硫酸铵对肌红蛋白的分离起到一定的作用，但高浓度盐析后的样品纯度反而降低。

２．４盐析过程中Ｍｂ吸收波谱变化情况

将不同饱和度硫酸铵分离后的肌红蛋白上清液和沉淀分别在３８０—４５０和４５０—７００ｎｍ处进行波谱扫描，结果见图６和图７。由图可知随着硫酸铵饱和度增加，上清液肌红蛋白在３８０～４５０ｉｌｍ处最大吸收峰的吸光值逐渐降低，特征吸收峰峰点由

４１４４０６

ｎｍ蓝移到４０６ｎｍ处；而沉淀中吸收峰峰点为ａｍ，最大吸收峰的吸光值随盐析液饱和度的增

加而上升。在４５０—７００ｌｉｒａ处，上清液在５４０与

５７６

ｎｍ处的最大吸收峰值随着硫酸铵饱和度增加

逐渐下降，当硫酸铵饱和度大于８０％时，上清液

０．６Ｏ．５０．４

ＡＳ饱和度惕ｓａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆ０ｑｎ．）２

ｓｏ．

—＊一７０—８０—ｅ一９０—十一ｌｏｏ

—日一０—◆一４０—古一５０—＊一６０

《

ＡＳ饱和度惕ｓａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆ吖Ｅ）２ｓｑ

—＊一７０—８０—９—９０－．－－－４－－－－ｌＯＯ

—日一０—令一４０—各一５０—＊一６０

２Ｏ《

ｌ５１ＯＯ５ＯＯ

Ｏ．２Ｏ．１Ｏ．３

５５０６００６５０７００

波长／ａｍ

ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ

波长／ｎｍ

ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ

图６上清液肌红蛋白波谱扫描图

Ｆｉ昏６

Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓｃａｎｎｉｎｇｏｆｓｕｐｅｍａｔａｎｔ

第２期

何俊燕等：硫酸铵盐析法分离罗非鱼肌红蛋白的研究

２１

３．５３．Ｏ２．５２．Ｏ《

１．５１．０

Ｏ．８

ＡＳ饱和度惕ｓａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆ（ＮＨ．）２

ＳＯ．

Ｏ．６

《Ｏ．４

Ｏ．２

Ｏ．５Ｏ．Ｏ

３８０

４００

４２０

４４０

Ｏ．Ｏ

４５０

５００

５５０

６００

６５０

７００

波长，ｎｍ

ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ

波长／ｎ．１ｎ

ＷｆＶｅｌｅｎｇｔｈ

图７沉淀肌红蛋白波谱扫描图

Ｆｉｇ．７

Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓｃａｎｎｉｎｇｏｆｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ

中几乎观察不到肌红蛋白的特征吸收峰。当硫酸铵饱和度小于６０％时，沉淀在４５０—７００ｒｉｍ几乎观察不到Ｍｂ的特征吸收峰；当硫酸铵饱和度大于６０％时，Ｍｂ在４０６、５４０和５７６ｎｍ处的特征吸收峰逐渐凸显出来，与此同时，６３０ａｍ处的特征吸

收峰也渐渐呈现，但与前面２个峰相比不明显。

２．５

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鉴定Ｍｂ纯度

对不同硫酸铵饱和度盐析后的样品经ＳＤＳ—

ＰＡＧＥ电泳，以低分子量标准蛋白（分子量从大到小依次为９７．４、６６．２、４３、３１、２０和１４．４ｋＤ）

和马心肌肌红蛋白标准品作为参照，结果见图８和图９。由试验结果可知，不同种类蛋白的沉淀区间

图８肌红蛋白上清液ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳图

Ｆｉ昏８

ＳＤＳ—ＰＡＧＥ

ｏｆｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ

不尽相同，最先沉淀下来的是相对分子质量大的蛋白（图９），肌红蛋白分子量较小（约１７ｋＤ），当

硫酸铵饱和度为６０％时，沉淀中肌红蛋白条带出

现，而后逐渐清晰，同时其他杂蛋白条带也随着增多；而上清液则正好相反。这是由于当硫酸铵饱和

度大于６０％时，由于上清液中肌红蛋白含量极少，因此在电泳图上看不到明显的条带。从ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

图９肌红蛋白沉淀ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳图

Ｆｉｇ，９

ＳＤＳ—ＰＡＧＥｏｆｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ

电泳图可以看出，盐析肌红蛋白所需硫酸铵饱和度

区间为６０％～１００％。

３讨论

３．１硫酸铵饱和度与盐析液色泽的关系

肌红蛋白是肌肉组织中重要的色素成分之一，肌红蛋白含量越高，肉色越深ｍ１。因此，肌红蛋

白溶液颜色的深浅也可以间接反映肌红蛋白含量的多少。随硫酸铵饱和度的增加，Ｍｂ粗提液中蛋白质沉淀量增加，从而使上清液Ｌ’显著增加，ａ＋和ｂ。均显著减小；沉淀中肌红蛋白含量逐渐增大，

致使沉淀的Ｌ＋显著减小，ａ’和ｂ‘显著增大。此

南方水产

第５卷

外，直接反映红色的ａ＋在硫酸铵饱和度为４０％和５０％时无显著性差异（Ｐ＜０．０５），初步推断硫酸铵饱和度为４０％和５０％的上清液中肌红蛋白的含量无显著性差异。

３．２硫酸铵饱和度与肌红蛋白含量的关系

由于蛋白质在高浓度中性盐影响下可脱去水化层，所带电荷被中和，使蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出，但蛋白质的盐析作用是可逆过程，经水或缓冲液稀释时又可溶解。因此，随着硫酸铵饱和度增加，上清液中肌红蛋白含量逐渐减小；反之，沉淀中肌红蛋白析出量逐渐增多。３．３硫酸铵饱和度与肌红蛋白纯度和回收率的关系

硫酸铵对肌红蛋白的分离起到一定的作用，高浓度盐析后的样品回收率较高但纯度不够高，这可能是由于随着硫酸铵饱和度的增加，肌红蛋白沉淀下来的同时，其他一些杂蛋白也随之沉淀下来。若想要达到更高的纯度，可以使用葡聚糖凝胶过滤和离子交换层析法进一步分离。

３．４硫酸铵饱和度与Ｍｂ吸收波谱的关系

Ｍｂ的呈色作用源于其分子内的血红素辅基，血红素辅基中铁离子的价态以及结合的不同基团的共同作用使Ｍｂ及其衍生物吸收光谱特性各不相同，因而使Ｍｂ及其衍生物呈现不同的颜色¨１ｌ。ＧＩＵＬＩＥｒｌＴＡ等¨２１报道在３８０—４５０ａｍ处，ｍｅｔ—Ｍｂ的吸收峰为４０６ａｍ，ｏｘｙ．Ｍｂ为４１４ａｍ；在４５０—

７００

ｎｍ处，ｏｘｙ．Ｍｂ的典型吸收峰为５４２和５７７

ｎｍ，ｍｅｔ—Ｍｂ的典型吸收峰为５０２和６３１ｎｍ。特征吸收峰的有无可以反映肌红蛋白的存在与否，肌红蛋白的存在形式决定特征吸收峰的位置，而总蛋白浓度的变化影响最大吸收峰值的变化。加入不同饱和度的硫酸铵后，肌红蛋白在３８０～４５０ｌｌｍ的特征吸收峰均发生蓝移，当硫酸铵饱和度增加到６０％时，６３０ａｍ处特征吸收峰开始出现，这２种现象

说明新鲜鱼肉中肌红蛋白主要以氧合肌红蛋白形式

存在，在盐析过程中部分氧合态的肌红蛋白转化为高铁肌红蛋白；上清液在３８０～４５０和４５０—

７００

ｎｍ处最大吸收峰的吸光值随着硫酸铵饱和度

的增加逐渐降低，而沉淀恰好相反，结合总蛋白浓度的测定结果可以推断在硫酸铵盐析肌红蛋白时，其他杂蛋白也随之被沉淀出来，使上清液中总蛋白浓度降低，沉淀中总蛋白浓度升高，从而导致上清液最大吸光值降低，沉淀最大吸光值升高。据上述结果可以推知肌红蛋白析出所需硫酸铵饱和度区间为６０％一１００％。

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０ｆｔｈｅｈｅａｄ

ｏｆ

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