红曲霉固态发酵中生物量的测定方法_路秀玲

第27卷　第6期　　路秀玲等:红曲霉固态发酵中生物量的测定方法45

红曲霉固态发酵中生物量的测定方法

路秀玲　赵树欣　刘忠华

(天津轻工业学院食品工程系, 天津, 300222)

摘　要　探讨了红曲霉固态发酵中生物量的测定方法。红曲霉固态发酵的生物量基本可以通过测定红曲霉菌体细胞中的麦角固醇和氨基葡糖含量来推断, 对于本文中红曲霉固态发酵采用氨基葡糖法相对较好, 可以估测出固态发酵物中的菌体量。底物干重减重与菌体量存在一定的正向关系, 通过测定底物减重可以推断出红曲霉生长代谢状况, 并且方法简便易行, 易于实现在线监测。

关键词　红曲霉　生物量　固态发酵

　　目前对红曲霉发酵的研究多集中于液态发酵, 但固态发酵与液态发酵相比具有产量

较高、后处理简单、对环境污染小、产品更安全等优点。固态发酵中生物量的测定方法国内报道很少, 国外多集中为以下4大类:(1) 直接从固态培养基中分离测定, 如除去基质、直接计数等; (2) 通过检测代谢活动推断生物量, 如测定O 2和CO 2的代谢量、胞外酶量、ATP 等; (3) 测出生物体中某些特殊物质(如蛋白质、总糖、核酸、氨基葡糖、麦角固醇等) 的含量推测生物量; (4) 利用与菌体生长有关的某些现象(如压降、底物减重等) 估测生物量[2]。红曲霉菌丝发达, 与培养基结合紧密, 故无法直接测定。从报道的结果中可以看出各种间接测定方法均有一定的局限性, 如产生单位菌体量所需的O 2量或排放的CO 2量会随菌龄变化

[3]

[3]

造成的底物减重与生物量的关系。力求确定一种操作简便, 能快速准确测定生物量或反映生物生长状态的方法。

1　材料与方法

1. 1　菌　种

烟灰色红曲霉(Monascus fuliginoscus ) 。1. 2　测定方法1. 2. 1　纯菌体的制备

采用膜培养法:在麦芽汁平板上铺一层无菌的玻璃纸, 吸取由斜面制得的孢子悬浮液0. 5mL 铺于膜上。30℃保温培养7d , 再降到25℃培养到14d , 然后将菌膜从玻璃纸上剥下, 80℃烘干即为纯菌体。1. 2. 2　固态发酵样品的制备

将大米浸泡10h , 洗净沥干, 称40g 装入250m L 三角瓶121℃高压蒸米30min , 冷却后接入孢子悬浮液1m L (含孢子约107个) , 调初始水含量为50%。30℃保温培养7d , 再降到25℃培养15d , 成品于80℃烘干, 磨成粉即为待测样。

1. 2. 3　发酵底物减重的测定

每次取3个250m L 三角瓶, 将其中的固态发酵物于80℃烘干, 准确称其干重, 计算其与初始发酵底物干重的差值即为底物减重。

; 细胞的特殊生物组

分含量会因不同菌种、培养条件和培养时间而不同; 检测时间长、过程繁复影响测定

的精确性, 因此很难判定哪种检测方法最好。有关红曲霉固态发酵生物量测定方法尚未见报道, 综合对固态发酵生物量问题的研究结果, 本文选用较为准确且易行的几种方法:测定细胞中的特殊物质如麦角固醇、氨基葡糖等组分含量推测生物量(核酸提取过程复杂, 故不采用) ; 研究由于生物体代谢释放CO 2

第一作者:硕士研究生。-

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1. 2. 4　麦角固醇含量的测定方法

红曲霉发酵物1g 或干菌体0. 5g (空白不加) 置于100mL 磨口三角瓶中, 加入

12mL 50%KOH 、20m L 甲醇, 85～90℃皂化1. 5h , 再加4m L 95%乙醇继续皂化1. 5h , 冷却后加蒸馏水8m L 、正庚烷20mL , 振荡30s , 静置30min 分层。取上层清液0. 5mL , 加4. 5m L 95%乙醇, 752型紫外分光光度计测定282nm 吸收值。1. 2. 5　麦角固醇含量标准曲线的绘制准确称取适量的麦角固醇(Sigm a ) 标准品, 配制成系列溶液, 用752型紫外分光光度计测282nm 吸收值。以浓度为横座标, 吸收值为纵坐标, 绘制麦角固醇含量的标准曲线。1. 2. 6　氨基葡糖含量的测定方法

待测样(干菌体0. 3g 、干米曲0. 6g ) 加2mL 60%H 2SO 4, 25℃浸泡24h , 稀释至1mol /L H 2SO 4, 置于250m L 三角瓶, 9. 8×104Pa 高压加热1h , 冷却后用1mol /L NaOH 中和至pH7, 定容到100mL 。取0. 5mL (空白为0. 5mL 蒸馏水) 加1m L 乙酰丙酮试剂(1. 5m L 乙酰丙酮+50mL 1. 25mol /L Na 2CO 3) , 90℃加热1h , 冷水冷却后加入Eu -rlich 试剂520nm 比色测定[5, 6]。

1. 2. 7　氨基葡糖含量标准曲线的绘制

准确称取适量的氨基葡糖(Sigm a ) 标准品, 配制成系列溶液, 用721型分光光度计测520nm 吸收值。以浓度为横座标, 吸收值为纵坐标, 绘制氨基葡糖含量的标准曲线。

[4]

条件(麦芽汁糖度分别为10°和12°) 所得菌体的麦角固醇含量(图3) 。由图3可见, 菌

图1　麦角固醇含量标准曲线

图2　菌体的麦角固醇含量

2　结果与讨论

2. 1　麦角固醇含量测定

麦角固醇含量的标准曲线如图1。由此

得到麦角固醇含量与吸收值的函数关系:

麦角固醇含量(μg /mL ) =29. 3A 282。图2为同一培养时间不同质量纯菌体的麦角固醇含量, 由此可以看出, 同时期红曲霉菌体中的麦角固醇含量是与菌体量成正比的。

图3　不同培养时间和营养条件的菌体

体中麦角固醇含量随培养时间不同而发生变化, 但在5～13d 变化不大; 其受培养条件的影响较大, 在麦芽汁糖度低即营养不良时, 麦角固醇含量较高。分析其原因, 可能是由于麦角固醇多存在与菌体的质膜中, 营养不良时孢子增多质膜加厚, 麦角固醇含量增加, 不同菌龄质膜变化较小, 麦角固醇含量也略有

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高的曲线拟合方程, 得到麦角固醇含量与培养时间的函数关系:

y =0. 0117t 3-0. 3181t 2+2. 745t -2. 4406

R 2=0. 964

y ———麦角固醇含量/mg t ———培养时间/d 。2. 2　氨基葡糖含量的测定

麦角固醇含量-氨基葡糖含量的标准曲线如图4。由此得到氨基葡糖含量与吸收值的函数关系:

氨基葡糖含量(mg ) =55. 25A 520。

图5为同一培养时间不同质量纯菌体的氨基葡糖含量, 由此可以看出, 同时期红曲霉菌体中的氨基葡糖含量是与菌体量成正比的

。

R =0. 985y ———氨基葡糖含量/mg t ———培养时间/d 。

2

图5　菌体的氨基葡糖含量

图6　不同培养时间和营养条件的

图4　氨基葡糖含量标准吸收值曲线

菌体氨基葡糖含量

测定了不同培养时间及不同培养基营养

条件(麦芽汁糖度分别为10°和12°) 所得菌体的氨基葡糖含量(图6) 。由图6可见:菌体中氨基葡糖含量随培养时间增加而增加, 但不同营养条件其含量变化不大, 营养不良情况下氨基葡糖含量略有增加。分析原因, 可能是由于氨基葡糖为细胞壁几丁质的主要成分, 细胞壁的厚度随菌龄而增加, 而菌龄较大或营养不良时, 空菌丝及孢子较多, 细胞壁所占比例较大[7], 故氨基葡糖含量偏高。同样考虑到固态发酵时营养充足, 故对糖度高的曲线拟合方程, 得到氨基葡糖含量与培养时间的函数关系:

2. 3　对固态发酵生物量的分析

2. 3. 1　固态发酵不同时期的生物量

由于此红曲霉最适生长温度为30～32℃,从现有的研究报道看产Monacolin K 的最适温度为25℃,一般培养时间为12d , 因而对于本固态发酵拟采用变温培养, 即初期30℃培养7d , 每日定量补足挥发的水分, 使菌体大量生长, 之后降至25℃,刺激其产生次级代谢产物, 此时菌体本身产水较多, 无需额外补水, 再培养至15d 。经初步实验结果较好, 故对此培养条件下菌体生长情况进一步研究。由于固态发酵具有显著的不均一性, 每个实验数据点均经过3次取样获得。

发酵不同时期的麦角固醇和氨基葡糖含

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质。由图7、8可见, 固态发酵物中的麦角固醇和氨基葡糖含量变化趋势类似。由于菌体的麦角固醇和氨基葡糖含量随菌龄变化, 图9对比了纯菌体中麦角固醇、氨基葡糖含量

分别为定值和变量时推得的发酵物的菌体含量。含量为定值时, 设菌体中麦角固醇和氨基葡糖含量为培养7d 时的数值, 即麦角固醇含量为4. 86mg /g 干菌体, 氨基葡糖含量为76. 3mg /g 干菌体。含量为变量, 即由各自的含量与培养时间的函数关系推出不同培养时期纯菌体的麦角固醇和氨基葡糖含量, 再应用下面公式推知菌体量:

固态发酵固态发酵物的麦角固醇或氨基葡糖含量

的菌体量每克纯菌体的麦角固醇或氨基葡糖含量

图9　不同方法推算所得的菌体量

波动较为明显。氨基葡糖含量虽然随菌龄逐渐增大, 但是对环境敏感性较小。由菌体形态观察可知, 琼脂培养的菌体7d 后大都成熟, 有限的营养制约了菌丝体的生长, 使其大部分进入成熟期及衰老期, 同时产生大量孢子, 而固态培养基质营养充足, 到12d 还多为旺盛的菌丝体, 细胞内氨基葡糖含量变化应较拟合的方程小。所以在实际应用上选取测定发酵物中氨基葡糖含量的方法, 并设菌体细胞氨基葡糖含量为76. 3mg /g 干菌体来推算固态发酵物中的生物量。并由此得到红曲霉在该条件下固态发酵菌体量随时间变化方程:

y =0. 0003t 4-0. 0064t 3+0. 044t 2-0. 0692t +0. 0349

R 2=0. 9749

y ———菌体量/g ·g -1(干固物) t ———培养时间/d 。

2. 3. 2　底物干重减重与菌体生长

由于生物体代谢吸收O 2放出CO 2, 营养不断被消耗, 底物总重也在逐渐减少。图10为底物干重减少量与培养时间的关系曲线。

图7　

发酵物中的麦角固醇含量

图8　发酵物中的氨基葡糖含量

底物减重与菌体量变化基本一致:前7d 菌体量一直上升, 底物干重持续下降, 7～11d 菌体生长缓慢, 底物减重不多, 11d 后菌体量再次回升, 底物减重也迅速增加, 至15d 趋于缓和。底物减重与菌体量具有一定的正向图, :

由图9可见, 麦角固醇和氨基葡糖推测出的菌体含量类似。从四条曲线看, 其发展趋向相同, 较为一致地显示菌体量的变化情

况, 可以选择一种作为菌体量测定参数。麦

角固醇受培养条件和检测过程的影响较大,

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y =49. 168x 2+9. 4692x -0. 4379R 2=0. 9572y ———菌体减重/g x ———菌体量/g ·g

-1

　　红曲霉固态发酵的生物量, 基本可以通过测定红曲霉菌体细胞中的麦角固醇和氨基葡糖含量来推断, 通过对比研究选取测定发

(干固物)

。

酵物中氨基葡糖含量的方法, 并设菌体细胞

氨基葡糖含量为76. 3mg /g 干菌体。但此方法仅仅是估测菌体量相对大小, 并不能准确测定出固态发酵物中真实的菌体含量, 并且测得的菌体量中也有可能包含一些衰老和死亡的生物体。

底物干重减重与菌体量存在一定的正向函数关系, 通过测定底物减重可以推断出红曲霉生长代谢状况, 即表征菌体生长旺盛、代谢活跃的程度, 并且方法简便易行, 易于实

图10　

发酵底物减重图

现在线监测。

参

考

文

献

1　Mitchell D A . Solid Substrate Cultiv ation . London :Elsever Science Publisher LT D . , 1992. 52～63

2　Sugama S , Okazaki N . J . Ferment . T ech -nol . , 1979, 57:408～412

3　Desgranges C , V ergoig nan C , Georges M et al . Appl . M icrobiol . Biotechnol . , 1991, 35:200～205

4　张博润, 蔡金科, 刘永成. 微生物学通报, 1993, 20(6) :335～338

5　Sakurai Y , Lee T H , Shio ta H . Ag ric . Biol . Chem . , 1977, 41:619～624

6　小崎道雄, 北原觉雄. 日本食品工业学会志, 1974, 21(1) :38～41

7　刑来君, 李明春. 普通真菌学. 北京:高等教育出版社, 1999. 26～29

图11　底物减重与菌体量关系曲线

可见由底物减重可以分析出生物体生长代谢的活跃程度, 而且方法简单易行并可实现在线监测。

3　结　论

Biomass Estimation of Monascus in Solid -state Fermentation

Lu Xiuling 　Zhao Shuxin 　Liu Zhonghua

(Foo d Engineering Department , Tianjin University of Lig ht I ndustry , T ianjin , 300222)

ABSTRAC T 　Methods for biomass estimation of Monascus in solid -state fermentation w ere dis -cussed . The amount of biomass could be estimated by the concentration of g lucosamine or ergos -terol in mycelial cells . Glucosamine method w as thought to be better to estim ate biomass . While

the result was only the relative amount , w hich couldn ' t show the real biom ass exactly . Biom ass viability could be estimated by dry matter w eight loss . The method w as simple , convenient and could be determined on line , but it w as only fit for comparison and character description . Key words 　Monascus , biomass , solid -state fermentation