高效液相色谱法

高效液相色谱在蛋白质分离中的应用

蛋白质是生命有机体的主要成分，在生命体生长发育的各个阶段都起着重要作用。所以蛋白质的分离和检测一直是人们研究的热点。Regnier认为：蛋白质是分子大小、形状和表面都不均一且各具特征的半僵硬分子。这就赋予蛋白质分离和检测以不同的特点[1]。目前，高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC) 技术广泛地应用于蛋白质的分离和检测，是由于具有许多优点：①与结晶、过滤等传统分离方法相比较，其分离效果更佳，且一次可得2 个以上的高纯度组分；②分析速度快，一般可以在30min内完成；③灵敏度高，可达ng或pg级，检出范围宽；④方法灵活机动，只需更换色谱柱和检测器，便可适用不同的分离要求；⑤样品回收简单。近来，因为色谱泵的改进 (可产生105MPa 的压力)而出现的特高效液相色谱(VHPLC)，使得蛋白质的分离更加快速高效，HPLC 技术日趋成熟，已成为分离和检测蛋白质的重要工具。

1 HPLC的基本原理

HPLC由液体输送系统、进样系统、色谱柱和检测系统4部分所组成。输液泵将流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，利用混合物中各物质在两相间分配系数、吸附力大小、带电性质，乃至分子量大小的差异而被分离，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离[2]。各组分依照并依次随流动相流至检测器，将检测到的信号送至数据系统记录处理或保存。随着HPLC技术的日趋成熟，它已成为分离和检测蛋白质的重要工具。 2 蛋白质的HPLC分离模式

蛋白质在物理、化学及功能上的差异为蛋白质的分离检测提供了基础。根据蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性、功能等特性，以及蛋白质的来源、实验要求等，可以选择不同的模式来分离目标蛋白。

2.1 反相高效液相色谱(reverse phase high performance liquid chromatography，

RP- HPLC ）

RP-HPLC在HPLC各种模式中的应用最为广泛，其特点是固定相的极性小于流动相的极性，蛋白质分子因其疏水性的不同，使其在两相中的分配不同而得

以分离。近10几年来，RP-HPLC，以其高分辨力、快速、重复性好等优点广泛应用于蛋白质的分离、分析。但目前比较流行的C18色谱柱在蛋白质的检测方面并不多见。这是因为蛋白质分子的混合物要在RP-HPLC中得到分离，必须有极性的差异，且在固定相和流动相中都有分配，而蛋白质通常都是强极性的化合物，与C18的结合较困难。另外，RP-HPLC常用的流动相，如甲醇、乙腈等都能使蛋白质变性沉积而导致色谱柱报废。因此，当RP-HPLC用于蛋白质分析时，一般需要低pH值流动相、较高的温度及使用乙腈或异丙醇作为有机部分，三氟乙酸（TFA）作为离子对试剂，是反相色谱中最常用的添加剂[3]。蛋白质的保留性质和选择性与反相色谱键合固定相的性质有关，实验证明，大孔硅胶(20～30nm)短链烷基(C4和C8) 键合固定相适合蛋白质的分离；而无孔径载体柱对分子量相差较大和疏水性很强的蛋白质混合物的分离效果很好。随着研究的深入，越来越多的小分子蛋白质和多肽已经能够使用RP -HPLC进行分离分析[4]。

2.2 高效亲和色谱(high performance affinity chromatography，HPAFC)

蛋白质在行使功能时必须和底物、受体或抑制剂等分子进行生物专一性结合，亲和色谱分离利用的便是这种高度专一结合的特性。HPAFC 是蛋白质检测中最专一的分离技术，它可以从复杂的混合物中直接分离到目标蛋白质，特别适合疫苗、糖蛋白和抗体等的分离纯化。HPAFC可以分离纯化酶、抗体、抗原、结合蛋白、受体蛋白、辅助蛋白等，也可以分离变性蛋白、化学改性蛋白等，在蛋白质化学中起着重要作用[5]。目前乳源性的功能蛋白，如乳铁蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白等，都可以用该法得到纯化。

2.3 高效离子交换色谱(high performance ion exchange chromatography，HPIEC)

离子交换色谱是最早被用于蛋白质分离的一种方法，因为离子交换色谱要求被分离样品具有带电性质的差异，而等电点的差异，以及在不同pH值溶液中带电性质会发生变化这一特性，恰恰是蛋白质所具备的。HPIE是根据蛋白质分子在一定pH值和离子强度条件下所带电荷的差异进行分离的方法。这种技术已经成功地应用于分离大多数的水溶性蛋白质，包括水解以后的多肽乃至氨基酸，并且当选择流动相的pH值合适时，能维持蛋白质的生物活性[6]。由于HPIEC是吸附性的梯度洗脱过程，所以具有很好的负载力。并且，人们的研究证明，HPIEC

与RP-HPLC都是分离膜蛋白的首选方法。在离子交换色谱填料研究方面，聚合物离子交换剂颇受重视。因为这种固定相具有稳定性好、离子交换容量大、对蛋白质的分离有选择性等特点[7]。

2.3.1 阴离子交换色谱

大多数蛋白质在生理pH值为6~8时，都带负电荷，因此常用阴离子交换色谱来分离。如人乳或牛乳中的骨桥蛋白，通常就可以用pH值5.0~7.0的弱阴离子交换色谱纯化[8]。采用阴离子交换色谱分离乳蛋白时，一般是有针对性的分离某一种蛋白质时的效果较好，如分离骨桥蛋白时，纯度可以达到85%以上，但是如果要将大多数常量蛋白质都同时得到分离，则必须与其他手段(如膜分离或分子筛)联用。

Tirang R.用多种色谱技术联用的方法分离了乳蛋白中的高丰度组分乳白蛋白、乳清蛋白和血清蛋白。在分析乳蛋白中的低丰度组分时，阴离子交换色谱通 常被作为一种筛分的手段，它可以将乳蛋白依照等电点的差异分为不同的部分，最终依靠二维电泳的手段进行鉴定。

2.3.2 阳离子交换色谱

对于乳品中一些等电点较高的蛋白质，如乳铁蛋白(Lactoferrin)，采用强阳离子色谱的分离手段则更为有效。且在分离乳铁蛋白的同时，乳过氧化物酶(Lactoperoxidase)也可以得到分离[9]，如将强阳离子交换柱与超滤的方法相结合，最终乳铁蛋白的纯度可以达到94%。

2.4 高效凝胶过滤色谱(high performance size exclusion chromatography，

HPSEC)

凝胶过滤色谱也称体积排阻色谱，是根据分子相对大小进行分离的一种色谱技术。相对于吸附性液相色谱技术而言，HPSEC的分辨力和样品负载力都很低。但是HPSEC是一种相对温和的技术，可用在范围较大平衡柱及分离样品的缓冲液，它对于流动相选择的要求不高，适用范围广，只是用HPSEC分离时，出峰的峰宽通常比较大，对于分子量差异较小的组分，分离度不高。

Zorbax GF- 250/450 凝胶过滤色谱柱是分离蛋白质和其他生物分子的理想色谱柱。当GF- 250/450柱串联使用时，球形蛋白的分离范围为4000-900000。GF- 250/450 柱具有亲水的二醇基，可实现蛋白质的高回收率(一般>90%)，并且

对硅胶进行了独特的氧化锆改性，从而将pH适用范围扩展为3-8。另外，一些有机聚合树脂也可以作为填料，它们经交联硬化后，成为亲水、刚性、多孔、球型的颗粒，比硅胶载体具有更大的pH值范围。GF- 250/450 柱填充有尺寸精确的多孔硅胶微球，孔径和粒径分布窄，可用于流速高达3mL/min时的蛋白质分离。这些色谱柱与流动相中的有机改性剂和变性剂相兼容，消除了蛋白质的聚合，从而实现正确的蛋白质分子量测定。一些常见的应用包括蛋白质单体、二聚体和聚合体的分离、脱盐、蛋白质分子量估算和改性蛋白质的分离。

Bunger等运用HPSEC成功地分离出疏水性肺的表面活性剂蛋白SP-B、SP- C，另外HPSEC特别适合对蛋白质分子量的研究，利用HPSEC能够快速分离出人血清白蛋白HAS的降解产物，结合特定的检测器即可测定其单体和二聚体的分子量。

由于 HPSEC相对温和的色谱条件，不会导致蛋白质和多肽的变性，故常用作一些乳源性生物活性多肽的制备，如用乳白蛋白和酪蛋白制备血管紧张素抑制肽，在对β-乳球蛋白体外降解的组分进行分离分析时，采用HPSEC能够较好地保持产物多肽的物理化学性质[10]。

2.5 高效疏水色谱(high performance hydrophobic interaction chromatography，

HPHIC)

高效疏水色谱是用来分离构象不稳定蛋白质的技术之一，其分离机制类似于反相液相色谱，只是用水性缓冲液代替了有机溶剂，以键合氟化物作固定相，在用SDS或CTAB作为流动相的HPHIC中，胶束提供了一个溶质溶解的非均相环境，可用于蛋白质的分离。蛋白质在分离过程中会重新发生折叠，因而在变性乳蛋白的检测中表现出优势[11]。近年来，人们将非线性色谱理论应用于蛋白质的分离，更加完善了高效

液相色谱技术。

3 多维高效液相色谱

3.1 多维高效液相色谱技术的发展

高效液相色谱技术作为一种高效的蛋白分离方法在现代的分析测试中发挥着愈来愈重要的作用。与一维分离模式相比，多维分离技术的最大特点是拥有更大的峰容量。

蛋白质组学出现之后，蛋白质组学研究主要有两种路线：第一种是传统的双向凝胶电泳分离技术。但是双向凝胶电泳技术仍然存在许多不足和一些难以克服的缺陷，比如有限的动态范围，分离样品中分子量差别较大的蛋白、低拷贝蛋白、疏水蛋白以及极酸极碱蛋白的分辨能力比较差，而且其操作过程费时费力，自动化程度低。针对这些固有的技术上的缺陷，具有快速，高效，自动化程度高等优点的液相色谱技术得到了长足发展，并成为蛋白质组学研究的第二条技术路线。发展两维乃至多维色谱分离技术，提高峰容量和分离能力是根本上解决复杂样品分离问题的方法。从理论上说，只要组合在一起的两种模式的分离机理正交，整个二维系统的峰容量是每一维峰容量的乘积，特别适合于复杂样品的分析。多维高效液相色谱技术以其快速、高效、自动化程度高以及易于与质谱等其他技术联用等优势再次成为研究应用的热点，以shotgun技术为代表的多维液相色谱技术得到了空前的发展。

较早采用的是以制备级等电聚焦电泳作为第一维，以反相液相色谱(RPLC)为第二维的联用系统实现对蛋白质的分离。Lubman及其合作者使用Rotofor液相等电聚焦电泳仪对细胞裂解液中的蛋白质一次性进行等电聚焦，然后以RPLC作为第二维进行分离。该方法在自动化和通量方面比双向凝胶电泳技术有着明显的优势。VerBerkmoes及其合作者运用阴离子交换色谱作为第一维色谱对酵母细胞的蛋白样品进行分离，所得每一个馏分都被分为两份：一份酶解后由质谱鉴定，另一份利用电喷雾傅里叶变换离子回旋共振质谱(ES I-FTICR-MS)进行相对分子质量的测定，两组结果对照起来对目标蛋白质进行分析，在完成对未知蛋白质鉴定的同时得到了蛋白质的分子量等信息。

高明霞[12]等设计了基于强阳离子交换色谱/毛细管反相液相色谱(SCX/cRPLC)的全二维液相色谱平台用于完整蛋白质的分离，同时发展了快速靶上酶解技术，实现了液相色谱分离与质谱鉴定的耦合。随后他们进一步优化该系统以弱阴离子交换柱 (WAX)代替强阳离子交换柱，建立了WAX /RPLC分离系统，选择 WAX代替 SCX作为第一维可以减少样品损失，并且上样量得到提高；RPLC作为第二维有分辨率高的优势，同时可以在线除盐。由于完整蛋白质的分离情况得到了有效改善，所以对于蛋白质的鉴定效率得到了提高，同时也保留了有关完整蛋白质的信息。

3.2 多维高效液相色谱的缺陷

目前多维色谱分离模式还存在一定的缺陷。首先是系统的通量有限。由于二维系统的第二维是单支反相色谱柱，所以不得不采用串联型操作模式。第二维的反相色谱柱只有对前一个一维馏分分离之后，才能对后一个馏分进行分离，如此循环，直至将所有馏分分离完毕。目前最具有代表性的二维液相色谱系统是LC-Packings纳升级HPLC系统，其主要工作流程是先将蛋白质混合物进行酶解得到多肽混合物，然后进样到强阳离子交换色谱柱，以阶梯方式增加盐的浓度，依次将每个馏分直接洗脱并进样到反相液相色谱柱上，洗脱除盐后，按照线性模式增加乙腈浓度,对保留在反相液相色谱柱上的组分进行梯度洗脱分离，用串级质谱对分离的馏分进行鉴定。该系统的自动化程度高，但是第二维单支反相色谱柱所提供的分析通量有限，串联式操作模式使样品分析时间大为延长。

多维色谱分离模式的第二个缺陷是第二维采样频率不能满足顺序型操作模式的需要。对于所有的在线全二维/多维分离系统，均要求样品在两维间进行有效的转移才能保证各组分的分离效率不受后续分离的影响，尤其对第二维(后一维)的分离速度有极高的要求。

4 小结

HPLC法具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、灵敏度高、分离和测定一次完成等优点。在实际应用中，可以根据蛋白质的不同生理特性，特别是进行复杂样品的分离时，通常需要采用几种分离模式结合使用，从而获得理想的目标产物。

蛋白质组学出现之后，多维高效液相色谱系统以其快速、高效、自动化程度高以及容易与质谱等其他技术联用等优势而成为蛋白质组学相关分析技术中研究应用的热点。但该技术仍有一些缺点亟待解决。

HPLC法分离蛋白质的不同模式，可对其他领域如医药、 临床病理、 预防学等蛋白质化学领域蛋白质的研究提供强有力的手段。同时也看到，这些色谱柱存在各自的侧重点，很难找到一种符合全部要求的理想的色谱柱，所以利用HPLC法分离蛋白质的研究还会继续，以发现更方便、快速、灵敏度更高，通用性更好的HPLC分析方法，推动蛋白质化学的发展。

参考文献

[1]周云龙，张著森.高效液相色谱分离和检测蛋白质[J].龙岩学院学

报,2006,24(6)：72-75.

[2]马燕芬,陈志伟.高效液相色谱在牛初乳成分分离检测中的应用[J].乳业科学

与技术,2007，(2)：76-80.

[3]鲁碧楠，许丽娜，韩旭，彭金咏.蛋白质分离分析中的色谱技术新进展[J].

中国现代应用药学杂志,2009,26(13)：1116-1121.

[4]Yuwei Qian，Ken Preston，Oleg Krokhin,et al.Characterization of Wheat

Gluten Proteins by HPLC and MALDI TOF Mass Spectrometry[J].J Am Sco Mass Spectrom,2008，19(10)：1542-1550.

[5]唐玲玲，夏明.高效液相色谱法在蛋白质分离检测中的应用[J].农产品加

工,2009,(1)：89-92.

[6]Dedem，Luuk A M，Van der Wielen，et al.Selection of pH-related parameters

in ion-exchange chromatography using pH-gradient operations[J]. Journal of Chromatograph A，2008，1194(1)：22-29.

[7]Ender Unsal，Taskin Irmak，Elifnaz Durusoy，et al.Monodisperse porous

polymer particles with polyionic ligands for ion exchange separation of proteins[J].Analytica Chimica Acta，2006，570(2)：240-248.

[8]N Azuma，A Maeta，K Fukuchi，et al.A rapid method for purifying

osteopontin from bovine milk and interaction between osteopontin and other milk proteins[J].International Dairy Journal，2006，16(4)：370-378.

[9]Conan J Fee，Amita Chand.Capture of lactoferrin and lac toperoxidase

from raw whole milk by cation exchange chromatography[J].Separation and Purification Technology,2006，48(2)：143-149.

[10]Samira Roufik，Sylvie F Gauthier.Physicochemical characterization

and in vitro digestibility of β-lactoglobulin/β-Lg f142-148 complexes [J].International Dairy Journal，2007，(17)：471-480.

[11]Emilia Bramanti，Wes W C Quigley，Chandra Sortino，et al.

Multidimensional analysis of denatured milk proteins by hydrophobic interaction chromatography coupled to a dynamic surface tension detector[J].Journal of Chromatography A，2004，1023(1)：79-91.

[12]高明霞，关霞，洪广峰，张祥民.多维高效液相色谱技术在蛋白质分离研究

中的进展[J].色谱，2009，27(5)：551-555.