酶作用机制

第十章 酶的作用机理和酶的调节

南京工业大学 制药与生命科学学院 何冰芳

酶的活性中心和必需基团

酶的特殊催化能力只局限一定区域 只有少数AA残基参与底物结合和催化作用。

一、酶的活性中心

酶的必需基团(essential group): 与酶活性直接有关的基团 酶的活性中心(active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关 的特定区域.

酶活性中心示意图

S- S

活性中心外 必需基团 活 性 中 心 必 需 基 团

底物

结合基团

催化基团 肽链

活性中心

多肽链 底物分子 活性 中心 以外 必需 基团 酶活性中心 活性 催化基团 中心 必需 结合基团 基团

有的酶的必需基团 兼有两者的功能

胰凝乳蛋白酶活性部位示意图

一些酶活性中心的氨基酸残基

酶

牛胰核糖核酸酶 溶菌酶 牛胰凝乳蛋白酶 牛胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 弹性蛋白酶 枯草杆菌蛋白酶 碳酸酐酶

残基总数

124 129 245 238 212 240 275 258

活性中心残基

His12, His119, Lys41 Asp52, Glu35 His57, Asp102, Ser195 His46, Asp90, Ser183 Cys25, His159 His45, Asp93, Ser188 His46, Ser221 His93-Zn-His95,His117

酶活性部位的共同点

1．活性部位在酶分子中只占一小部分（1％～2 ％） 2．酶活性部位是一个三维的特定空间结构 3．酶活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，裂 缝内往往是个疏水的微环境。 4．底物通过次级键结合到酶上，形成ES复合物。 5．酶活性部位是柔性或可运动性，即酶与底物结 合时构象发生一定的变化才互补。

研究酶活性部位的方法

1．分子侧链基团的化学修饰法 2、动力学参数测定法 3、射线晶体结构分析法 4、定点诱变法

二、酶反应的独特性质

• 酶反应；一类反应仅涉及电子转移，另一类 反应涉及电子和质子两者或其他基团的转移 • 酶催化作用以残基上的功能基团和辅酶为媒 介，如His, Ser, Cys, Lys, Glu, Asp • 酶催化反应的最适pH范围狭小 • 酶活性部位比底物稍大 • 酶除进行催化反应所必需的活性基团外，还 有其他因素，如使底物产生张力等作用因素

三、影响酶催化效率的有关因素

酶的专一性和高效率是由酶分子的特殊 结构决定的，与多种因素有关。

过渡态

一）底物和酶的邻近效应与定向效应

底物分子结合在酶的活性部位上，使作用基团互相 邻近并定向，使反应速度大大增加。 邻近效应:指酶与底物结合形成中间复合物以后， 底物与底物（如双分子反应）、酶的催化基团与底 物之间结合于同一分子上，有效浓度极大的升高。 定向效应:指反应物的反应基团之间及酶的催化基 团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。 Page等认为，邻位效应与定向效应在双分子反应中 起的促进作用，可加速反应10

4～108倍。

邻 近 效 应 与 定 向 效 应

缩 合 反 应

二）底物的形变和诱导契合学说 （ inducedfit） 酶结合底物时，酶中的某些基团可使底物分子内敏 感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生 O O 电子张力，底物分子变形－过渡态，降低活化能。 OOP CH 3 O OCH 3 O P

水解速度

1

（接近过渡 CH 2 CH 2 态） 108

O

三）酸碱催化

酸碱催化是通过瞬间的向反应物提供质子或 从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应 的一类催化机制。

狭义的酸碱催化 H+、OH-

酸碱催化

广义的酸碱催化，质子受体和供体

酶蛋白中具有广义的酸碱催化的功能基：氨 基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基等。

His存在于许多酶的活性中心；咪唑基是催化中很活泼的一个催化 功能基，它既能供出质子又能接受质子，且速度十分迅速，所 以，His在Pr的含量虽小，往往位于活性中心。

四）共价催化

共价催化又称亲核催化或亲电子催化，催 化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别 放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电 子中心或负电子中心，迅速形成不稳定的 共价中间复合物，稳定过渡态，加速反 应。 酶分子中的亲核基团有 Ser － OH 、 Cys － SH、His的咪唑基等。

共价亲电催化也包含辅酶产生的亲电中心；如 焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等。

共价催化

五）金属离子的催化

需要金属离子的酶几乎占1/3，金属酶分 1．金属酶：含紧密结合的金属离子，多属过渡金 属离子Fe2＋、Fe3＋、Cu2＋、Zn2＋、Mn2＋或Co3＋ 2．金属－激活酶；含松散结合的金属离子，通常 为碱和碱土金属离子。如Na＋、K＋、Mg2＋或Ca2＋ 金属离子以3种主要途径参与催化：a. 结合底物为 反应定向. b. 可逆地改变金属离子的氧化态调节氧 化还原反应. c. 静电作用稳定或屏蔽负电荷。

电荷屏蔽作用

电荷屏蔽作用是酶中金属离子的一个重要功能。 多种激酶(如磷酸转移酶)的底物是 Mg2+－ATP复合 物。

O O P O O Mg

2+

O P O O

O P O H

O

CH 2

O

A

H OH

H H OH

金属酶中的金属离子与配体

金属离子 配体

Mn2+ Fe2+/Fe3+

酶或蛋白

Cu+/Cu2+ Co2+ Zn2+ Pb2+ Ni2+

咪唑 丙酮酸脱氢酶 卟啉环，咪唑， 血红素， 含硫配体 氧化-还原酶， 过氧化氢酶 咪唑，酰胺 细胞色素氧化酶 卟啉环 变位酶 -NH3,咪唑,-(RS)2 碳酸酐酶,醇脱氢酶 -SH d-氨基α-酮戊二酸脱水酶 -SH 尿酶

对于需要辅酶的酶来说，活性中心就是辅酶分 子以及与辅酶分子紧密偶联的蛋白质结构区 域。

六）多元催化和协同效应

酶的活性中心部位，一般都含有多个起催 化作用的基团，这些基团在空间有特殊的 排列和取向，可以对底物价键的形变和极 化及调整底物基团的位置等

起到协同作 用，从而使底物达到最佳反应状态。 酶催化反应往往是几个基元催化反应配合 在一起共同起作用。不同酶起主要作用的 因素不同。

七）活性部位微环境的影响

在酶分子的表面有一个裂缝，而活性 部位就位于疏水环境的裂缝中，底物 分子与催化基团之间的作用力在疏水 的微环境中大大增大。

四、酶催化反应机制的实例

• 胰核糖核酸酶RNaseA • 丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶催化三连 体）

胰核糖核酸酶 RNase A 的折合实验

RNaseA含124AA残基4个二硫键，若枯草杆菌蛋白 酶限制性水解成S肽(20)和S蛋白(104) 分开后S蛋白无活性，S肽与S蛋白保温恢复活性 S肽再切开;(1－13AA)肽与S蛋白一起保温，恢复 70％活性，说明14～20并非必需。

Lys41

His12、Lys41、His119构成RNaseA的活性中心

胰核糖核酸酶 RNase A的催化机理

水解磷酸二酯键，形成2，3－环磷酸酯中间 体。P

CH 2 H H O O P O CH 2 H H O OH O H H B O P OO P O OOOH

Py

O H H

P

CH 2

P Py

O H H O O

His12 Lys41

RNase A

H

His119

H 2O

CH 2

Py

O H H O OH

H

H

+

H H

His119

Lys41

P

结合P.402 RNaseA的水解机理来认 识活性中心 His12、Lys41、His119

胰 凝 乳 蛋 白 酶

丝氨酸蛋白酶

His57,Asp102,Ser195

胰凝乳蛋白酶

胰 凝 乳 蛋 白 酶

P.410

胰凝乳蛋 白酶

胰凝乳蛋白酶 作用机理

胰凝乳蛋白酶 作用机理

胰凝乳蛋白酶 作用机理

胰凝乳蛋白酶 作用机理

胰凝乳蛋白酶 作用机理

胰凝乳蛋白酶 作用机理

胰凝乳蛋白酶 作用机理

五、酶活性的调控

酶的调控

酶量的调节— mRNA转录水平上的调控 酶活力的调控 1、别构调控 2、酶原的激活 3、可逆的共价修饰

1．三、四级结构与酶活的关系－别构调整 活性部位; 结合底物和催化底物 调节部位；结合调节物和效应物 寡聚酶多为别构酶，由多亚基构成-次级键两部 位可在同一亚基上，也可在不同亚基上。 别构酶分子上可有一个以上的活性部位和调节 部位。两者在空间上是分开的，但可通过构象 上的变化产生相互影响，产生协同效应(正和负 协同)。

别构调节：酶分子的非催化部位与调节 物可逆地非共价结合后发生构象改变， 进而改变酶活性，称为酶的别构调节。 效应物（别构剂、调节物）：能使酶分 子发生别构作用的物质。 正效应物(别构激活剂)别构导致酶活增 加。 负效应物(别构抑制剂)别构导致酶活降 低。

生物界许多代谢途径的 关键酶利用别构调节来 控制代谢途径间的平衡 同促效应：底物对别构酶 的调节作用 异促效应：非底物分子调 节物对别构酶的调节作用

调控部位 Regulatory site

蛋白激酶

v

米氏酶 变构激活 变构酶 变构抑制

[S]

变构酶的S形曲线

别构酶不符合米氏

方程

别构模型

Monod 等 （ 1965 ） 提 出 齐 变 模 型 。 Koshland 等 （1966）提出序变模型。多数别构酶有更复杂的调节 过程。 别构酶的齐变模型：蛋白质的每种亚基具有两种构象 一种是有利于底物或调节物结合的松弛型构象（R 型），另一种是不易结合的紧张型（T型），在外界条 件影响下亚基间的T态与R态变化是同时进行的，不存 1、有确定数目的亚基 在RT杂合态。多运用于正异促效应。 2、每个亚基对一种配体只

S

S

T型

R型

有一个结合位点S 3、R/T的三、四级结构及 催化活性不同 4、无RT杂合态

S

别构模型

别构酶的序变模型：在亚基与配体结合时，诱导T 态向R态转变，并影响邻近亚基对下一个配体的亲 和力，序变机制中有TR杂合态的存在。

S

S

S

S

T型

R型

序变模型；1、不存在配体时，别构酶只有一种构象（T)

2、别构酶构象以序变方式变化，有RT杂合态存在 3、亚基间的作用可以是正协同也可以是负协同 4、该模型适合于大多的别构酶

2、酶原激活

酶原和酶原的激活

酶原：酶的无活性的前体 酶原的激活：由无活性的酶原转变为有 活性的酶的过程。 酶原激活的意义：在特定的环境和条件 下发挥作用；避免细胞自身消 化。

机体中的酶原激活

• • • • 使蛋白水解的消化酶 血液凝固系统的酶 蛋白激素 皮肤、骨骼中的纤维蛋白—胶原等

蛋白酶原激活

肠激酶或 胰蛋白酶

缬 天 天 天 天 赖 异 缬 甘

静电吸引 力或氢键

组 46

X 丝

183

S S

胰 蛋 白 酶 原 活性中心

-S-S-

游离的六肽

缬 天 天 天 天 赖

缬 异

X

组 丝

S S

胰 蛋 白 酶

-S-S-

胰蛋白酶原的激活过程

胰蛋白酶原

肠激酶

胰凝乳蛋白酶原 六肽 +

自 身 催 化

弹性蛋白酶原

胰蛋白酶

α-胰凝乳蛋白酶 +二肽 羧基肽酶原A 弹性蛋白酶 + 碎片 羧基肽酶A + 碎片

肠激酶启动的酶原激活

胰岛素原

胰岛素

3、可逆的共价修饰

酶的共价修饰调节： 酶蛋白分子上的一些基团可与某种化学基团 发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性。 常见修饰方式： 磷酸化和去磷酸化 共价调节酶往往是代谢流量起调节作用的关 键酶，这种调节反应灵敏。

肌肉中磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化过 程：

ATP ADP 蛋白激酶

E

磷酸化酶-b

E 磷蛋白磷酸酶 H2O

P 磷酸化酶-a

无活性

P

有活性

主要的化学修饰类型

• • • • • • 磷酸化／去磷酸化 乙酰化／去乙酰化 腺苷化／去腺苷化 尿苷酰化／去尿苷酰化 甲基化／去甲基化 S－S／－SH

酶促化学修饰对酶活性的调节

酶

糖原磷酸化酶 磷酸化酶b激酶 糖原合成酶 丙酮酸脱羧酶 磷酸果糖激酶 丙酮酸脱氢酶 HMG-CoA还原酶 HMG-CoA还原酶激酶 乙酰CoA羧化酶 脂

肪细胞甘油三脂脂肪酶 黄嘌呤氧化酶

化学修饰类型

磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 磷酸化/脱磷酸化 -SH/-S-S-

酶活性改变

激活/抑制 激活/抑制 抑制/激活 抑制/激活 抑制/激活 抑制/激活 抑制/激活 激活/抑制 抑制/激活 激活/抑制 脱氢酶/氧化酶

六、同工酶 Isozyme

能够催化相同的化学反应， 但是分子结构不同的一类酶。 特点

存在于同一机体的不同组织或同一细胞的不 同亚细胞结构。 在生理，免疫及理化性质上存在差异 由两个以上亚基聚合而成，不同同功酶的亚基 组合情况不同。

乳酸脱氢酶LDH

H COH + NAD+ CH3 COOH COOH H COH + NADH + H+ CH3

H4 H3M1 H2M2 H1M3 M4

Liver Muscle White cell Brain

H4

H3M1 H2M2 H1M3

M4

Red cell Kidney Heart

－

原点

LDH5 M4 (心肌) LDH4 M3H LDH3 M2H2 LDH2 MH3 LDH1 H4 (骨骼肌)

＋

人体心,肝和骨骼肌LDH同工酶谱

组织器官 心 肝 骨骼肌 正常血清 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 （ 占总 LDH活性的百分比） 35~70 28~45 2~16 0~6 0~8 2~10 3~33 6~27 1~10 4~18 8~38 9~36

27.1±2.8 34.7 ± 4.3 20.9 ± 2.4 11.7 ± 3.3

LDH5 0~5 30~8 40~97

5.7 ± 2.9

a

2

1

2

b

3 1 4 酶活性 5 酶活性 3 4 5

迁移位置 (a)

迁移位置

LDH同工酶电泳图谱

(b)

（a）正常人LDH同工酶电泳图谱,（b）心肌梗塞病人血清LDH同工酶电泳图谱

酶缺乏或异常引起的疾病

酶 疾 病

苯丙氨酸羟化酶 6—磷酸葡萄糖脱氢酶 酪氨酸酶 细胞色素氧化酶 胆碱酯酶

苯丙酮酸尿症 蚕豆病 白化病 氰化物中毒 有机磷中毒

问答及计算题 1、什么是同功酶？各有何特点？ 2、阐述酶具有高效率及高度专一性的机理。 举例说明。