鸡骨骼肌卫星细胞的分离培养.鉴定及生物学特性研究

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研究快报

鸡骨骼肌卫星细胞的分离培养#鉴定及生物学特性研究

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陈! 岩) ! 王! 琨) ! 朱大海) !

! 哈尔滨工业大学分子与细胞发育生物学实验室$哈尔滨) ) @$’’’) *" 中国协和医科大学医学分子生物学国家重点实验室$北京) ! @’’’’$

摘! 要! 采用#型胶原酶和胰蛋白酶二步消化$经体外培养获得鸡骨骼肌卫星细胞$并通过检测肌卫星细胞特异基因的表达进行鉴定) 结果表明#二步消化法适用于鸡骨骼肌卫星细胞的分离和获取$此方法分离得到的鸡骨骼肌卫星细胞表达卫星细胞特异的标志基因/并具有良好的增殖和分化能力$为鸡骨骼肌细胞增殖%分%$*01+-和234化和再生机制的研究提供技术平台) 关键词! 鸡*骨骼肌*卫星细胞*肌肉发生

中图分类号! +!!! N #*#@&!!! 文献标识码!

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(&) 年由Y 7-0/在蛙的肌!! 肌卫星细胞最早于)

) ’

肉中发现&卫星细) 在动物个体生长发育过程中$胞不断增殖并补充到成长的肌纤维中) 在成体肌组织中$卫星细胞处于有丝分裂休眠期即Q 形成’期$

收稿日期! 修回日期! ! ’’$’%! (" ! ’’$) ’! "

潜在的生肌细胞库) 区分卫星细胞的形态学特征包括核质比相对较高%细胞器较少%与相邻肌纤维核大小相近) 当受到应急%牵拉%损伤或其他刺激因素作用下卫星细胞被激活$表现为细胞一极或两极出现

基金项目! 国家自然科学基金重点项目! 编号#%国家杰出青年科学基金项目! 编号#和国家" 编号##’##’*#’" #’’! $’! %" &#计划!

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作者简介! 陈! 岩! $女$硕士研究生$专业方向#遗传学) (&) ("

#*#通讯作者! 朱大海$教授$博士生导师$研究方向#肌肉发育与信号传导) L K F 78:3? M ? --F ; @23-@; 9H 2:’) ’K &$) ’$’" ) " .

’! 胞质突起%核质比提高以及细胞器增多&) 它们在

浴中消化#取上清液分) 加培养基终止反应$’F89别用#+’’目和$’’目滤膜过滤) 过滤液! ’’’0F 89离心%贴壁#?后$放入’@) [明胶铺底的培养瓶中$" 加入卫星细胞培养基#G ) ’[马血清! ; :/92]) ’[5" 胎牛血清! 自制" G ; :/92]#[鸡胚提取物! ]%%[5$置#; :/92" A Y L Y 培养基! %\%$[>^G ! 培养箱5

中培养) *" ! %!? 后换液和进行形态学观察) ) @! @! ! 卫星细胞总I 6+的提取及I H K E >I 扩增

" 采用H 提取贴壁生长’%08M /:试剂! X 9J 810/29C 肌纤维损伤时能迁移至受损肌组织处$彼此相互融因此骨骼肌卫星细胞被合或与原有的肌纤维融合$

认为是维持骨骼肌生长和损伤后肌纤维再生的主要

#’

) 来源&

结蛋白! 是肌细胞内细胞骨架中间丝的" 32B F 89构成成分$是较早表达的肌源性标志蛋白之一$体外培养形态类似于卫星细胞的成纤维细胞不表达这种蛋白$因此结蛋白是鉴定肌卫星细胞的标志蛋白之

一&*! &’

) 已知234

%是静止期和增殖期卫星细胞特异表达的转录调控因子$因此成为鉴定肌卫星细胞

的重要标志蛋白&%’

) 静止期的肌卫星细胞并不表达

6@

7$和6" H ! 家族成肌调控因子或其他已知的肌终末分化标记基因$随着肌卫星细胞的增殖和分化逐渐表达6@7$%6@7. *-+-等成肌调控因子) 因此通过检测234%%6@7$%6@7. *-+-等基因的表达变化可以探知卫星细胞的增殖分化状态)

存在于动物肌组织中的卫星细胞可通过酶消化%体外培养而富集$肌卫星细胞的体外培养是研究骨骼肌细胞增殖%

分化和再生机理的关键技术) 本实验室主要从事蛋鸡和肉鸡骨骼肌发育差异的遗传学基础研究$肉用仔鸡的骨骼肌生长速度远远超过蛋鸡$由于出雏后的肌纤维数是相对恒定的$骨骼肌的生长主要表现为肌纤维的肥大$

肌纤维肥大主要来源于肌卫星细胞的增殖和与原有肌纤维的融合) 因此$通过比较蛋鸡和肉用仔鸡肌卫星细胞增殖分化能力的不同$

可为探讨蛋鸡和肉鸡骨骼肌发育差异的分子机理提供重要线索) 本研究旨在建立鸡骨骼肌卫星细胞分离%培养和鉴定技术$为鸡骨骼肌发育调控机理和蛋鸡肉鸡骨骼肌发育差异的机制研究提供技术平台)

! 材料和方法

@) ! 材! 料

本研究选用出雏*3的海蓝褐雄性蛋鸡$取自东北农业大学禽类孵化厂) @! ! 方! 法@! @) ! 鸡卫星细胞的分离和培养

取出雏后*3的雄性蛋鸡的胸肌$剔除血管%结缔组织$将肌组织剪成尽量小的块) 用’Z ) [胶原蛋白酶#! , 8C F 7" $#%\水浴中消化#’! *’F89$去掉消化液*再加’@! $[的胰蛋白酶! , 8C

F 7" $#%\水! *%*" %%!? 的肌卫星细胞总I 6+$

具体方法详见说明书) 根据鸡的234%%6@7$%6@7. *-+-%! I 39? +-基因F I 6+序列设计引物$由上海生工生物工程技术服务有限责任公司合成) E 7W %! 6Y , ! ’$’&$" #上游$_K +>H Q >>>++>>+>+H >>Q >>+H ++Q K #_$下游$_K Q H H Q Q >+Q Q +Q >H Q >+Q >+H H >+H Q K #_*Y 5

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>+H +>H >>H Q >H H Q >H Q +H >K #_) 以卫星细胞提取的总I 6+为模板$/:8C /3H 为引物$用Y Y ‘J 逆转录酶! X 9J 810/C 29" 进行逆转录反应$获得; A 6+第一链) 取$%‘稀释) ’倍的; A 6+第一链进行; A 6+第二

链合成及E >I 扩增) 在! ’%‘的E >I 体系中含有! %‘)’aE >I 缓冲液$) ’. F /:+%

‘的引物各) %‘$! %

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6+聚合酶! H 7R 7I 7" $加水至! ’%‘) E >I 扩增程序为#(*\$F89*(*\*$B$$$\*$B$%! \) F 89$共#’个循环*循环结束后%! \继续延伸) ’

F 89) E >I 产物经’@" [的琼脂糖凝胶电泳检测) ) @! @#! 卫星细胞增殖生长曲线的测定

取原代培养的) a ) ’*

细胞$放入’@) [明胶铺底的(&孔板中$! *?细胞贴壁伸展后换液$

每孔加入) %>8!

#G K H 3I ) 在’%&%) ! %! *%*"? 后$分别终止培养$消化收集细胞于玻璃纤维滤纸上*" ’\烘箱中

烘干#’F89) 将滤纸放入闪烁杯中$放入闪烁液$液闪仪测定闪烁数! 即; . F 值" ) ) @! @*! 免疫荧光染色

取原代培养的) a ) ’*

细胞$放入’@) [明胶铺

底的&孔板中$! *?细胞贴壁伸展后$*[甲醛固定

) ) ) )

液固定) %$’F 89E b , 清洗*)c$’E 7W %! A , G b " 室温孵育) ? " $32B F 89抗体! +b I+==89818/0272915b C

武汉博士德" 室E b , 清洗*) c !’’’抗鼠K ; #二抗! 5$! 温孵育)? 同时加A 武汉博士德" 进E b , 清洗*+E X 行核染色) 同时用正常牛血清代替一抗作阴性对照) 封片后荧光光学显微镜下观察照像)

情况) 实验结果显示#! *? 细胞增殖达到旺盛高峰*细胞逐渐停止增殖$开始融合$形成肌管%*" ? 之后$

肌纤维! 图! "

)

! ! 结果和分析

! " #! 鸡骨骼肌卫星细胞的获得与增殖生长曲线的

测定!! 经酶消化后的肌卫星细胞为球形$

在铺有明胶的培养瓶中$! *? 后开始贴壁$*" ? 贴壁完全并开始增殖) 贴壁后绝大多数细胞为梭形或纺锤形$有两极$体积小$胞核折光性强) 少数细胞呈多角形$有突起$

联结成网) 随培养时间延长$细胞增殖%迁移逐渐形成规律性的平行排列) *" ! $!? 后$细胞进入分化阶段$细胞增殖速度减慢$细胞相互靠拢%融合$形成肌管! 图) "

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图; ! 分离培养的鸡骨骼肌卫星细胞

+#贴壁! *?$为长梭形单核细胞! *’倍" *b #贴壁*"?

$细胞靠近$开始彼此融合! *’倍" *>#贴壁%!?

$肌管出现! ! ’’倍" *A #

贴壁%!? $肌管出现! ) ’’倍" ) 2#$#19#

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为检测分离的鸡骨骼肌卫星细胞在体外的生长增殖状态$采用#G 标记的胸苷示踪卫星细胞的增殖

图C ! 分离培养的卫星细胞表达A %D E 和-, " ? ’(

+$b #应用抗E 7W %抗体作细胞免疫荧光和A +E X 染色*

>$A 应用抗3

2B F 89抗体作细胞免疫荧光和A +E X 染色) +$b $>$A #放大倍数为) ’’)

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) ’’K =/:3" @分别提取体外培养’%! *%*" %%!? 的卫星细胞总I 6+$采用I H K E >I 方法检测肌卫星细胞特异表

达的标记基因及卫星细胞分化过程中表达的成肌调控因子) 结果表明#刚分离的原代细胞! 几乎检" ’?而此时2测不到67$%17*-+-的表达$34%的表@@. 达量较高$说明分离得到的是处于静止期! 的Q ’期" 卫星细胞*生长! 细胞进入旺盛分裂期$成*?左右$肌调控因子67$%*-+-出现表达$23417%的表@@. 达量最高*开始分化%融*"? 后细胞逐渐停止增殖$合$分化因子6而肌卫星细胞的7*-+-表达升高$@. 标记基因2图*" ) 这些结果%的表达明显下降! 34但若大鼠骨骼肌在被取材前数日内受伤$则分离出的卫星细胞在增殖期前几乎没有潜伏期$大多数卫星细胞在分离出来时已处于, 期) 肌肉取材部位的选择在很大程度上影响了卫星细胞的产率$不同肌肉类型中卫星细胞的数目有所不同$慢收缩肌中

’(

卫星细胞数目多于快收缩肌中的数目&) 本研究所

用材料为胸肌! 快肌为主" $其卫星细胞发育的时间明显慢于腿肌! 慢肌为主" 中卫星细胞的发育进程)

本研究建立了鸡骨骼肌卫星细胞分离%培养的表明本研究分离得到的鸡骨骼肌卫星细胞具有较好的肌原性分化能力

)

图G ! 肌卫星细胞增殖分化标记基因的表达+, " " ’#(’(&2, >+#$’. , +%&’(1

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%&, $$’&,/, $$" ! 讨! 论

根据体外培养时的形态学特征及特异性基因表达出现的时间$动物个体发育过程中的成肌细胞群体大致分为胚胎%胎儿和成体成肌细胞) 在禽类中$胚胎成肌细胞在胚胎期$3时最多*胎儿成肌细胞在胚胎期" ! ) !3最多*而成体成肌细胞$即卫星细胞在胚胎发育晚期时出现$

是出生后主要肌源性前体细胞) 通过我们的实验验证$一般在出生后)V 内$卫星细胞数量能保持较高比例*其后$随着机体的生长$卫星细胞脱离细胞有丝分裂$进入静止期$其数量急剧减少)

据报道$随着年龄的增大$大鼠骨骼肌中分离的卫星细胞数目也随之下降$但卫星细胞的增殖分化

能力并不随年龄的增大而减弱&" ’

) 在对人骨骼肌卫

星细胞的研究中亦得到类似结果) A /3B /9等在研究鼠卫星细胞生长曲线时发现$随着大鼠年龄的增大$分离所得卫星细胞增殖期前的潜伏期明显延长)

方法$并在细胞形态学和分子表达水平对分离培养的卫星细胞进行了鉴定) 实验结果显示$在卫星细胞的静止期$不表达成肌调控因子$细胞核中能检测到卫星细胞标记基因234%的表达*当卫星细胞激活后$开始分裂%增殖%分化$则6@

7$家族成肌调控因子陆续表达) 增殖的卫星细胞相互融合$形成肌管) 鸡骨骼肌卫星细胞分离和体外培养技术的建立为研究鸡成体骨骼肌的发育及再生机制$尤其是为蛋鸡和肉鸡骨骼肌发育差异的机理研究提供了技术平台和理论基础) 参考文献$I , . , +, (/, "

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