枯草芽孢杆菌各子液发酵条件

２００８年４月第２期１１０～１１３

甘肃农业大学学报

ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＧＡＮＳＵＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

第４３卷

双月刊

枯草芽孢杆菌Ｂ２种子液发酵条件的研究

闫沛迎，陈秀蓉，薛

莉，杨成德

７３００７０）

（甘肃农业大学草业学院，甘肃兰州

摘要：采用单因子、双因子及正交试验，对枯草芽孢杆菌Ｂ２的培养液组成（碳源、氮源、酵母膏、ｐＨ值）及培养条件（装液量与转速）进行了研究。结果表明；以葡萄糖１％．牛肉胨０．８％。酵母膏０．５％及ｐＨ８制成的培养液，

装液量１００ｍＬ／２５０ｍＬ锥形瓶，转速１４０ｒ／ｒｎｉｎ．培养Ｂ２３６ｈ为最佳培养条件，在此条件下．活菌数可达２．９７×

１０１０ｃｆｕ／ｍＬ，分别是Ｄ培养液和ＮＢ培养液的２．０５倍和５２．３６倍．

关键词：枯草芽孢杆菌Ｂｚ；培养基组成；培养条件｝优化中图分类号：Ｓ

４７６＋．１１

文献标识码：Ａ文章编号：１００３—４３１５（２００８）０２—０１１０－０４

ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＢａｃｉｌｌｉｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＢ２

ＹＡＮＰｅｉ－ｙｉｎｇ，ＣＨＥＮＸｉｕ－ｒｏｎｇ，ＸＵＥＬｉ，ＹＡＮＧＣｈｅｎｇ—ｄｅ

（Ｃｏｌｌｅｇｅｏｆ

Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒｅ。ＧａｎａｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０・Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈ

ｓｉｎｇｌｅ—ｆａｃｔｏｒ，

ｄｏｕｂｌｅｆａｃｔｏｒｓａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｗａｓｃｏｍ—ｐｏｓｅｄｏｆｇｌｕｃｏｓｅ１０ｇ，ｂｅｅｆｐｅｐｔｏｎｅ８ｇ，ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔｐａｓｔｅ５ｇ，ｐＨ８，ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓｉ００ｍＬｉｎ’

ｖｅｎｔｏｒｙ／２５０ｍＬｆｌａｓｋｍａｔｃｈｉｎｇ

ｔｏ

ｔｈｅｒｏｔａｔｅｓｐｅｅｄｏｆ１４０ｒ／ｍｉｎ，ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ３６ｈ．Ｔｈｅ

ａ。

ａｃｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｑｕａｎｔｉｔｙｐｒｏｄｕｃｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓａｂｏｕｔｔｗｏ－ｆｏｌｄｔｈａｎｔｈａｔｉｎＤｍｅｄｉｕｍａｎｄｂｏｕｔｆｉｆｔｙ－ｆｏｌｄｔｈａｎｔｈａｔｉｎＮＢｍｅｄｉｕｍ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＢａｃｉｌｌｉｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＢ２；ｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ；ｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

枯草芽孢杆菌［Ｂａｃｉｌｌｕｓ

ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｅｈｒｅｂｅｒｇ）

枯草芽孢杆菌＆种子发酵液培养条件的优化，为其小试发酵提供生命力旺盛的种子液，旨为此菌株的商品化生产奠定一定的基础．１

Ｏｈｎ］是目前生物农药中研究最多的一种细菌微生物ｎ～．甘肃农业大学植物病理实验室于２０００年筛选出一株枯草芽孢杆菌岛，它对多种真菌病原菌具有明显抑制作用，进而对这一菌株的抗菌谱、抗菌活性物质、系统发育地位等进行了较为系统的室内研究，同时进行了该菌对豌豆根病、当归、黄芪根腐病等的防病促生效果的田间试验，其结果表明，这一菌株具有良好的防病促生作用［３“］，在生产中具有较大的应用潜力．本文是在前期研究的基础上，通过对

作者简介ｔ固沛迎（１９８０一）．女．甘肃景泰人．在读硕士。主要从事植

物病害生物防治的研究．

通讯作者Ｉ陈秀蓉．女，教授．Ｅ－ｍａｉｌｌｃｈｅｎｘｉｕｒｏｎｇ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．∞资助基金，甘肃省生物技术专项（ＧＮＳＷ・２００５－１０），甘肃省。５５５”创

新人才工程资助．

收稿日期ｔ２００７－０４－１６

材料与方法

１．１菌种

枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｉｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｂ２是甘肃农业大学植物病理实验室于２０００年筛选及保存至今的一株生防菌．

１．２培养基

。

ＮＡ培养基‘５］：用于菌株的活化及活菌数的

测定．

ＮＢ培养基嘲：用于菌株初次的液体摇瓶培养和对照培养．

Ｄ（ＮＹＤＡ）培养液：葡萄糖１０ｇ，牛肉胨８ｇ，酵母膏５ｇ，ｐＨ值７．０，水１

０００

ｍＬ．作为对照培养液

万方数据　

第２期

闫沛迎等：枯草芽孢杆菌Ｂ２种子液发酵条件的研究

与优化的种子培养液进行比较．１．３培养方法

摇瓶培养：将在ＮＡ培养基上活化培养２４ｈ的菌种接一环到ＮＢ培养液（装液量４０ｍＬ／１５０

ｍＬ

锥形瓶），置２８℃恒温培养箱培养２４ｈ后，以５％的接种量接入以下试验，在２８．ｃ和１００ｒ／ｍｉｎ（除双因素试验外）培养２４ｈ后，测定其活菌数．

１．４测定方法

活菌数测定：采用平板稀释法‘副．

１．５数据统计

所有数据用ＤＰＳ统计软件进行分析．２

试验设计

２．１正交试验

以葡萄糖、牛肉胨、酵母浸膏、ｐＨ值为４个因素进行Ｌ。。（４４）的正交优化试验，将筛选出的最佳组合的培养液编号为肛Ｉ培养液［¨］．

表１

Ｌ。。（４４）正交设计因素表

Ｔａｂ．１

Ｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｏｆｆｏｕｒｆａｃｔｅｒｓａｎｄｌｅｖｅｌｓ

２．２

ｐＨ值优化试验

根据２．１的试验结果，在已优化的肛Ｉ培养液的基础上，将ｐＨ值调为７、７．５、８、８．５四个梯度进一步优化，将次试验优化筛选出的最佳组合编号为胁Ⅱ培养液，同时与对照Ｄ培养液和ＮＢ培养液，在１．３的培养条件下进行试验比较．２．３双因素试验

装液量与转速组合的筛选：将装液量的３个水平Ｂｌ（８０ｍＬ／２５０ｍＬ），Ｂ２（１００ｍＬ／２５０ｍＬ），Ｂ３

（１２０ｍＬ／２５０

ｍＬ）和转速的３个水平Ａ１（１００

ｒ／ｍｉｎ），Ａ２（１２０ｒ／ｍｉｎ），Ａ３（１４０ｒ／ｒａｉｎ）组合在１．３

的培养条件下进行筛选．

２．４种子液最佳发酵时间的确定

将肛Ⅱ培养液确定为种子培养液，在双因素筛选出的最佳组合（转速与装液量）和１．３的温度培养

万　

方数据条件下培养，对每隔１２ｈ的种子液进行活菌数测定，以确定最佳发酵时间．

３，结果与分析

３．１正交优化试验

表２表明：在相同条件下，用１６种不同组合的培养液培养枯草芽孢杆菌岛，其活菌量有明显差异．培养液３中活菌数为４．０６×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ，而培养液１４中活菌数为２．３１×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ，为培养液３的５１．７２％，两者之间存在显著差异；其它１４种培养液的活菌数为１．３３×１０。～１．６７×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ，为培养液３的３２．７６％～４１．１３％，均与培养液３存在极显著差异，可见，培养液３较为理想，因此，初步确定培养液３为肛Ｉ培养液．

表２

Ｌ，・ｔ（４４）正交试验方案与结果

Ｔａｂ．２

Ｔｈｅｓｃｈｅｍｅａｎｄｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ

ｔｅｓｔ

表３结果表明，４因素在其４个水平上的最优组合（发酵液３）为葡萄糖１％，牛肉胨０．８％，酵母膏０．５％及ｐＨ值８；同时表明酵母膏是影响活菌数的主要因素，其次是ｐＨ值和牛肉胨，葡萄糖对活菌数的影响最小．

１１２

甘

肃农

业大学

学

报

２００８矩

表３

Ｌ－。‘（４４）正交优化试验结果分析

Ｔａｂ．３

Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ

ｔｅｓｔ

３．２

ｐＨ值优化试验

从图１可知，不同ｐＨ值条件对枯草芽孢杆菌

岛在种子发酵液中的长势有很大影响，当ｐＨ值为８时，活菌数达到最大（２．９７×１０１０ｅｆｕ／ｍＬ），与ｐＨ值为７、７．５、８．５时的活菌数呈显著差异．因此，Ｂ２发酵液的最适ｐＨ值为８，这与正交优化试验的结果相一致，即口Ｉ和ｎⅡ培养液组成相同．

１０．６

乙１０．４

羼

茸１０．２

童嚣

绻嬲貉．

；：ｉ

钱网

；妻瓣

荔７毒

８．８

；｝１．阻

蠡ｄ

ｔ，ｉ

７

７．５

８８．５

ｐＨ值

图１

ｐＨ值对活菌量的影响

Ｆｉｇ．１

ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐＨｏｎ

ｔｈｅａｃｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉａｑｕａｎｌｉｔｙ

３．３最佳培养液与其它两种培养液间的比较

由表４数据计算可得，最佳培养液中活菌数是Ｄ培养液的２．０５倍，是ＮＢ培养液的５２．３６倍，明显地提高了活菌量，为发酵旺盛的种子菌源量提供了较佳的培养基组合．

表４不同发酵液中的活菌数比较

Ｔａｂ．４

Ｔｈｅａｃｔｉｖｅ

ｂａｃｔｅｒｉｕｍｑｕａｎｌｉｔｙ

ｃｏｎｔｒａｓｔ

ｉｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｒｅｎｔｍｅｄｉａ

３．４装液置与转速组合的筛选

由表５可知，组合Ａｓ（１４０ｒ／ｍｉｎ）聩（８０ｍＬ／

２５０ｍＬ）和Ａ３（１４０

ｒ／ｍｉｎ）Ｂ２（１００ｍＬ１２５０ｍＬ）与

其它各组合之间均存在显著差异，而与除Ａ。（１００

万　

方数据ｒ／ｒａｉｎ）Ｂ１（８０ｍＬ／２５０ｍＬ）组合外的其他６个组合

之间达到了极显著性差异，Ａ。Ｂ。与Ａ。Ｂ２之间差异不显著，即Ａ。Ｂ－和Ａ。Ｂ２是较理想的组合．因考虑到

１００ｍＬ１２５０

ｍＬ的装液量比８０ｍＬ１２５０ｍＬ更实

用，所以选Ａ。Ｂ：为最佳组合．

表５因素方差分析

Ｔａｂ．５

Ｔｈｅｆａｃｔｅｒｖａｒｉａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ

组合均值／１０１０ｃｆｕ・ｍＬｌ

Ａ。ｂ

６．１３０００．ＡＡ３Ｂ２５．９９０００，ＡＡ１

Ｂｌ

３．４０００００柚Ａ３＆１，７９５００ｋｓＡ２岛

１．３８５００ｋ８Ａ２＆１．１７０ｏｏｋＢＡｌＢ０．２９０ＯＯｄＡ２岛

０．１８０

００ｃ８

Ａ１＆０．０２５００ｃＢ

３．５种子液最佳发酵时间的确定

由图２可以看出，种子液中的细菌生长到３６

ｈ

时，活菌量密度达到了最大（４．９７×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ），其生长达到了平台期，且与１２ｈ和３６ｈ所生长的活菌量之间呈显著性差异．因此，将种子液的最佳发酵

时间定为３６

ｈ．

通过对枯草芽孢杆菌Ｂ２种子培养基和种子液发酵条件的优化，确定较为理想的种子培养液（３号培养液，即肛Ｉ）和培养条件（装液量１００ｍＬ／２５０ｍＬ，转速１４０ｒ／ｍｉｎ）．

１２

Ｆ

量６

棚４

翼：

０

Ｏ１２２４３６４８６０

７２８４９６

时间，ｈ

图２如生长动态曲线

Ｆｉｇ．２

Ｔｈｅｇｒｏｗｔｈ

ｃｕｒｖｅ

ｏｆ岛

４

讨论

从正交结果分析可知，发酵液中碳源对活菌量

的影响最小，这与胶质芽孢杆菌发酵条件的研究结果一致ＣｘｏＪ，在小试或中试发酵中，为培养基组成中廉价碳源的利用提供了理论依据．

溶氧量对于好氧菌株的发酵是至关重要的［ｎ】，

第２期闫沛迎等：枯草芽孢杆菌Ｂ２种子液发酵条件的研究

１１３

本试验就影响溶氧量的有限因子（装液量和转速）进行了探索，并未确定Ｂ２菌株种子液培养所需的确切溶氧量，这还需要更深入的研究．

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枯草芽孢杆菌B2种子液发酵条件的研究

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

闫沛迎， 陈秀蓉， 薛莉， 杨成德， YAN Pei-ying， CHEN Xiu-rong， XUE Li， YANGCheng-de

甘肃农业大学草业学院,甘肃,兰州,730070甘肃农业大学学报

JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSITY2008，43(2)1次

参考文献(11条)

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