关于茚三酮法测定脯氨酸含量中脯氨酸与茚三酮反应之探讨

植物生理学通讯　　第４１卷　第３期，２００５年６月365

测定脯氨酸含量的方法通常用磺基水杨酸或酒精提取再与酸性茚三酮反应生成稳定的红色产物，然后于波长５２０　ｎｍ处比色，通过标准曲线或回归方程计算脯氨酸的含量。关于其测定原理，一些植物生理学实验指导明确指出：“在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色产物，用比色法于５２０　ｎｍ波长下测定脯氨酸的含

［１，２］

量。”然而，在各种生物化学教科书［３￣６］中描述氨基酸茚三酮反应时，则为：“在弱酸性条件下，２个亚氨基酸——脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应并不释放ＮＨ３，而直接生成黄色化合物，其结构式如图１，最大光吸收在４４０　ｎｍ。”为了对两种教材中不同的说法进行比较，我们查阅了各种文献，设计一些试验并进行了验证。

述主要在植物生理学逆境指标测定脯氨酸含量实验中［１，２，９￣１２］。这些文献认为脯氨酸与酸性茚三酮反应生成红色物质，有互变异构体Ｉ和ＩＩ（图２）。产物在酸性条件下最大吸收峰５２０　ｎｍ，碱性条件下最大吸收峰６３０　ｎｍ［１０］。反应体系是醋酸缓冲液、水合茚三酮、脯氨酸。

图２　　红色产物互变异构体Ｉ和ＩＩ

图１　　黄色产物

１　　两种说法的来源

关于黄色产物及其最大光吸收在４４０　ｎｍ的描述广泛存在于国内生物化学教科书［３￣６］和少数植物生理学实验指导［７］中，生化教科书一般没有指出该反应的具体反应体系，文献７在“实验５５”中同意生化教科书的说法并有详细步骤，根据其中的参考文献我们发现其主要来源于Ｈｙｍａｎ［８］的文献。文献８指出其反应体系由ＮａＣＮ、醋酸缓冲液、水合茚三酮组成，脯氨酸或羟脯氨酸与之反应后的产物是黄色的，最大吸收峰在４４０　ｎｍ。文献７来源是８，反应体系更改成为ＫＣＮ、柠檬酸缓冲液、水合茚三酮、脯氨酸。在文献７第３版［１］中则取消了这个试验。

关于红色产物及其最大光吸收在５２０　ｎｍ　的描

通过资料对比我们提出以下几个问题：（１）有无氰化物对反应产生何种结果？（２）酸性体系以柠檬酸为好还是醋酸为好？（３）产物在水相好还是甲苯相中更好？我们设计了相应试验并进行了验证。２　　验证试验

实验中用到的试剂有：１０　µｇ·ｍＬ－１标准脯氨酸溶液、酸性茚三酮溶液（２．５　ｇ茚三酮，加入６０ｍＬ冰醋酸和４０　ｍＬ　２　ｍｏｌ·L－１磷酸，于７０℃下加热溶解，冷却后贮于棕色试剂瓶中备用）、分析纯冰醋酸、０．２　ｍｏｌ·L－１　ｐＨ　５．０的柠檬酸溶液、ＫＣＮ。用各自不加脯氨酸的体系溶液调零，以龙尼柯（上海）仪器有限公司ＷＦＪ　７２００型可见光分光光度计测定可见光区域实验产物的吸收曲线。

收稿２００４－１１－１２修定　　　２００５－０１－２７

资助　国家自然科学基金（９０３０２００５）。

　　＊　　　　通讯作者（Ｅ－ｍａｉｌ：　ｌｉａｎｇｚｓ８１９＠１６３．ｎｅｔ　，　Ｔｅｌ：　０２９－８７０９２３７３）。

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２．１　　氰化物对反应的影响　　我们设定反应体系为：２　ｍＬ标准脯氨酸溶液、２　ｍＬ酸性茚三酮、２　ｍＬ冰醋酸，一支试管加入０．００５　ｇ　ＫＣＮ，另一试管不加ＫＣＮ，均于水浴中加热２０　ｍｉｎ。结合文献资料与实验结果（图３）发现，脯氨酸与茚三酮共热，有ＫＣＮ时产物为黄色，可见光区域最大吸收峰在４２０　ｎｍ处，说明结构可能为图１；无ＫＣＮ时产物为红色，最大吸收峰为５２０　ｎｍ，显示结构可能为图２。从化学反应机制来说，由于存在氰化物与不存在氰化物两种情况下生成的产物及其颜色不同，说明两者很可能是不同的反应。

色，吸收峰是４２０　ｎｍ。可见酸性强弱移动了吸收峰，显示其产物在不同ｐＨ下的结构是可变的。

ＫＣＮ是剧毒物质，为了安全、快速、准确测定起见，我们认为应采用无ＫＣＮ的脯氨酸与酸性茚三酮共热的体系更加合理。因此，以下实验都采用无ＫＣＮ的体系。

２．２　　不同酸性支持体系对脯氨酸与酸性茚三酮反应的影响　　在脯氨酸含量测定中，测定系统有用柠檬酸的［７］，更多是用醋酸［２，８￣１０］。我们分别用柠檬酸和醋酸进行了实验。图５中反应体系为：２　ｍＬ标准脯氨酸溶液、２　ｍＬ水合茚三酮、２　ｍＬ柠檬酸溶液。３支试管分别作未加热、水浴加热８　ｍｉｎ和水浴中加热２０　ｍｉｎ实验。结果（图５）显示：在未加热时，溶液颜色未发生变化，说明脯氨酸与茚三酮可能没有进行反应；在柠檬酸系统中，沸水浴中加热８　ｍｉｎ后，有淡红色产物生成，且在波长为５２０　ｎｍ处有最大吸收值；当继续加热到２０　ｍｉｎ时，出现了红色沉淀，将该红色沉淀过滤后测得的吸光值明显下降，但吸收峰仍为５２０　ｎｍ。

图３　　ＫＣＮ

对脯氨酸测定吸收曲线的影响

图４中，反应体系为：２　ｍＬ标准脯氨酸溶液、２　ｍＬ酸性茚三酮、０．００５　ｇ　ＫＣＮ，一支试管加入２　ｍＬ冰醋酸（ｐＨ　１．０），另一试管补充２　ｍＬ蒸馏水（１　ｍｏｌ·L－１　ＮａＯＨ调ｐＨ至７．０），均于水浴中加热２０　ｍｉｎ。结果显示：有ＫＣＮ、无醋酸时，反应产物呈黄色，产物吸收峰并不是４４０　ｎｍ，而是４３０　ｎｍ；有ＫＣＮ和醋酸时，反应产物呈橙黄

图５　　加热时间对测定脯氨酸柠檬酸体系吸收曲线的影响

　图４　　在ＫＣＮ存在时醋酸对脯氨酸测定中吸收曲线的影响

用冰醋酸取代柠檬酸，体积不变，用１　ｍｏｌ·L－１　　ＨＣｌ和１　ｍｏｌ　·L－１　ＮａＯＨ调ｐＨ至１．５，加柠檬酸的试管置于水浴中８　ｍｉｎ，加冰醋酸的试管在水浴中为２０　ｍｉｎ。结果（图６）显示：用柠檬酸时其特征吸收峰值较低；用醋酸时同样浓度的脯氨酸和茚三酮反应，加热８　ｍｉｎ后开始显现红色，２０　ｍｉｎ后溶液颜色深度稳定，产物特征吸收峰更明显。图５、图６的结果表明醋酸优于柠檬酸，以下实验均采用冰醋酸、脯氨酸、茚三酮反应体系。２．３　　水相与甲苯相对脯氨酸测定的影响　　产物可溶

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图６　　柠檬酸与醋酸对测定脯氨酸吸收曲线的影响

图８　　不同ｐＨ

下甲苯相中产物的吸收曲线

于水相与甲苯相，何种溶液相测定产物浓度最好？图７中反应体系为：２　ｍＬ标准脯氨酸溶液、２　ｍＬ酸性茚三酮、２　ｍＬ冰醋酸，分别用１　ｍｏｌ·L－１ＮａＯＨ调ｐＨ　１．０和３．０，于水浴中共热２０　ｍｉｎ。图８反应体系与图７相同，冷却后用甲苯萃取产物。结果表明，在可见光区域，不同ｐＨ值条件下生成的产物特征吸收峰不管溶于水相还是甲苯相都是５２０　ｎｍ，产物是红色。水相中ｐＨ的变化会极大影响产物特征吸收峰的吸收值（图７），而甲苯中ｐＨ的变化对吸收值几乎没有影响（图８）。

是醋酸作为酸性体系），加热反应后的最终产物是红色的。在这个反应中，脯氨酸应是缩合了两分子茚三酮，产物呈红色，最大吸收波长是５２０　ｎｍ附近，不是４４０　ｎｍ。脯氨酸与酸性茚三酮直接加热反应结果可能如下：

图７　　不同ｐＨ

下水相中产物的吸收曲线

在有氰化物参与时发生的是另一反应，产物是黄色的，仅缩合一分子茚三酮。反应结果可能如下：

３　　结束语

３．１　　两种反应的实质　　具α－氨基基团的氨基酸与酸性茚三酮反应为：氨基酸首先被氧化成醛、ＮＨ３和ＣＯ２，而茚三酮被还原；接着反应生成的氨和茚三酮还原产物再与另一分子水合茚三酮缩合生成紫色物质［１３］。

而脯氨酸与酸性茚三酮反应（不管是柠檬酸还

如果要对脯氨酸与酸性茚三酮反应做出详细、完整的反应历程说明，还需对产物结构作鉴

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定，对反应机制也应进一步研究。

３．２　　生化教材修改建议　　结合文献资料和我们的试验，我们认为，不少生化教科书描述脯氨酸与酸性茚三酮反应

［３￣６］

或回归方程计算含量。具体方法可参见文献１、２、９。

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值得商榷。首先，茚三酮反应

是特指有α－氨基基团的氨基酸与酸性茚三酮生成紫色产物的反应，产物进行比色测定时波长为５７０　ｎｍ［７］；　而脯氨酸和羟脯氨酸是亚氨基酸，没有独立的α－氨基，所以并不如平常所说的是简单的茚三酮反应。尽管如此，脯氨酸仍然能够与酸性茚三酮发生化学反应，但不属于普通意义上的氨基酸茚三酮反应。据此，我们认为生化教材在描

述脯氨酸与酸性茚三酮反应时应作适当修改：　（１）脯氨酸是亚氨基酸，没有具α－氨基的氨基酸酸性茚三酮反应；（２）脯氨酸可以与茚三酮反应，在酸性条件下生成的直接产物是红色的，最大吸收峰值是５２０　ｎｍ；（３）脯氨酸与茚三酮在有氰化物存在时反应产物是黄色或橙黄色，最大吸收值是４２０￣４３０　ｎｍ（准确的峰值需进一步提纯产物测定）。３．３　　最佳测定条件　　尽管脯氨酸和茚三酮反应的机制仍有待研究，但根据实验结果我们认为，如果从高效、安全的角度考虑宜采取如下方法：用醋酸作为酸性条件，茚三酮与脯氨酸水浴共热２０ｍｉｎ以上，反应产物用甲苯萃取，建立标准曲线